Molekulárna biológia ako vedecká prednáška Ph.D. Tazabaeva K.A

Molekulárna biológia

veda, ktorej cieľom je porozumieť podstate životných javov štúdiom biologických objektov a systémov na úrovni približujúcej sa molekulárnej úrovni a v niektorých prípadoch dosahujúcej túto hranicu. Konečným cieľom je zistiť, ako a do akej miery sú charakteristické prejavy života, ako je dedičnosť, rozmnožovanie vlastného druhu, biosyntéza bielkovín, excitabilita, rast a vývoj, ukladanie a prenos informácií, premeny energie, mobilita atď. , sú určené štruktúrou, vlastnosťami a interakciou molekúl biologicky dôležitých látok, predovšetkým dvoch hlavných tried vysokomolekulárnych biopolymérov (pozri Biopolyméry) - proteíny a nukleové kyseliny. Charakteristickým znakom M. b. - náuka o životných javoch na neživých predmetoch alebo takých, ktoré sa vyznačujú najprimitívnejšími prejavmi života. Sú to biologické útvary z bunkovej úrovne a nižšie: subcelulárne organely, ako sú izolované bunkové jadrá, mitochondrie, ribozómy, chromozómy, bunkové membrány; ďalej - systémy, ktoré stoja na hranici živej a neživej prírody - vírusy vrátane bakteriofágov a končiac molekulami najdôležitejších zložiek živej hmoty - nukleových kyselín (Pozri Nukleové kyseliny) a bielkovín (Pozri Proteíny).

M. b. - nový odbor prírodných vied, úzko súvisiaci s dlhodobo etablovanými oblasťami výskumu, ktoré zastrešujú biochémia (Pozri Biochémia), biofyzika (Pozri Biofyzika) a bioorganická chémia (Pozri Bioorganická chémia). Rozlíšenie je tu možné len na základe zohľadnenia použitých metód a základného charakteru použitých prístupov.

Základ, na ktorom sa M. b. vyvinul, položili také vedy ako genetika, biochémia, fyziológia elementárnych procesov atď. neoddeliteľne spojené s molekulárnou genetikou (pozri Molekulárna genetika) , ktorá naďalej tvorí dôležitú súčasť matematiky, hoci sa už z veľkej časti stala samostatnou disciplínou. Izolácia M. b. z biochémie je diktované nasledujúcimi úvahami. Úlohy biochémie sa obmedzujú najmä na zistenie účasti určitých chemických látok na určitých biologických funkciách a procesoch a na objasnenie povahy ich premien; hlavný význam má informácia o reaktivite a hlavných znakoch chemickej štruktúry vyjadrenej obvyklým chemickým vzorcom. Pozornosť sa teda v podstate sústreďuje na transformácie ovplyvňujúce hlavné valenčné chemické väzby. Medzitým, ako zdôraznil L. Pauling , v biologických systémoch a prejavoch života treba pripisovať hlavný význam nie hlavným valenčným väzbám pôsobiacim v rámci jednej molekuly, ale rôznym typom väzieb, ktoré určujú medzimolekulové interakcie (elektrostatické, van der Waalsove, vodíkové väzby atď.).

Konečný výsledok biochemickej štúdie môže byť prezentovaný vo forme jedného alebo druhého systému chemických rovníc, zvyčajne úplne vyčerpaných ich znázornením v rovine, to znamená v dvoch rozmeroch. Charakteristickým znakom M. b. je jeho trojrozmernosť. Esencia M. b. M. Peruts vníma biologické funkcie v zmysle molekulárnej štruktúry. Dá sa povedať, že ak predtým pri štúdiu biologických objektov bolo potrebné odpovedať na otázku „čo“, t.j. aké látky sú prítomné, a na otázku „kde“, v ktorých tkanivách a orgánoch, potom M. b. má za cieľ získať odpovede na otázku „ako“, keď sa naučil podstatu úlohy a participácie celej štruktúry molekuly, a na otázky „prečo“ a „načo“, keď na jednej strane zistil, súvislosti medzi vlastnosťami molekuly (opäť primárne bielkovín a nukleových kyselín) a funkciami, ktoré plní a na druhej strane úlohou takýchto jednotlivých funkcií v celkovom komplexe prejavov života.

Rozhodujúcu úlohu zohráva relatívna poloha atómov a ich skupín v celkovej štruktúre makromolekuly a ich priestorové vzťahy. To platí ako pre jednotlivé zložky, tak aj pre celkovú konfiguráciu molekuly ako celku. V dôsledku vzniku presne stanovenej objemovej štruktúry získavajú molekuly biopolymérov také vlastnosti, vďaka ktorým sú schopné slúžiť ako materiálny základ biologických funkcií. Tento princíp prístupu k štúdiu živých vecí je najcharakteristickejšou, typickou črtou M. b.

Historický odkaz. Obrovský význam výskumu biologických problémov na molekulárnej úrovni predvídal I. P. Pavlov , ktorý hovoril o poslednom štádiu vedy o živote – fyziológii živej molekuly. Samotný výraz „M. b." Prvýkrát bola použitá angličtina. vedec W. Astbury pri aplikácii na výskum týkajúci sa objasnenia vzťahov medzi molekulárnou štruktúrou a fyzikálnymi a biologickými vlastnosťami fibrilárnych (vláknitých) proteínov, ako je kolagén, krvný fibrín alebo svalové kontraktilné proteíny. Široko používať výraz „M. b." ocele od začiatku 50-tych rokov. 20. storočie

Vznik M. b. Ako vyspelá veda sa zvykne datovať do roku 1953, keď J. Watson a F. Crick v Cambridge (Veľká Británia) objavili trojrozmernú štruktúru deoxyribonukleovej kyseliny (DNA). To umožnilo hovoriť o tom, ako detaily tejto štruktúry určujú biologické funkcie DNA ako materiálneho nosiča dedičnej informácie. V zásade sa táto úloha DNA stala známou o niečo skôr (1944) ako výsledok práce amerického genetika O. T. Averyho a jeho kolegov (pozri Molekulárna genetika), ale nebolo známe, do akej miery táto funkcia závisí od molekulárnej štruktúra DNA. To sa stalo možným až po vyvinutí nových princípov röntgenovej difrakčnej analýzy v laboratóriách W. L. Bragga (pozri stav Bragg-Wolff), J. Bernala a iných, ktoré zabezpečili využitie tejto metódy pre detailné poznanie priestorovej štruktúry makromolekuly proteínov a nukleových kyselín.

Úrovne molekulárnej organizácie. V roku 1957 J. Kendrew stanovil trojrozmernú štruktúru Myoglobínu a , av ďalších rokoch to urobil M. Perutz v súvislosti s Hemoglobin a. Boli sformulované predstavy o rôznych úrovniach priestorovej organizácie makromolekúl. Primárna štruktúra je sekvencia jednotlivých jednotiek (monomérov) v reťazci výslednej molekuly polyméru. Pre proteíny sú monoméry aminokyseliny , pre nukleové kyseliny - Nukleotidy. Lineárna, vláknitá molekula biopolyméru v dôsledku výskytu vodíkových väzieb má schopnosť určitým spôsobom zapadnúť do priestoru, napríklad v prípade proteínov, ako ukázal L. Pauling, získať tvar špirály. Toto sa označuje ako sekundárna štruktúra. O terciárnej štruktúre sa hovorí, keď sa molekula so sekundárnou štruktúrou tak či onak ďalej zloží a vyplní trojrozmerný priestor. Nakoniec, molekuly s trojrozmernou štruktúrou môžu interagovať, prirodzene sa nachádzajú vo vzájomnom priestore a vytvárajú to, čo sa označuje ako kvartérna štruktúra; jeho jednotlivé zložky sa zvyčajne nazývajú podjednotky.

Najzrejmejším príkladom toho, ako molekulárna trojrozmerná štruktúra určuje biologické funkcie molekuly, je DNA. Má štruktúru dvojitej špirály: dva pramene prebiehajúce vo vzájomne opačných smeroch (antiparalelné) sú skrútené okolo seba a tvoria dvojitú špirálu so vzájomne sa dopĺňajúcim usporiadaním báz, t.j. tak, že oproti určitej báze jedného reťazca je vždy rovnaký v druhom reťazci báza, ktorá najlepšie zabezpečuje tvorbu vodíkových väzieb: adenín (A) tvorí pár s tymínom (T), guanín (G) s cytozínom (C). Táto štruktúra vytvára optimálne podmienky pre najdôležitejšie biologické funkcie DNA: kvantitatívne množenie dedičnej informácie počas procesu bunkového delenia pri zachovaní kvalitatívnej invariantnosti tohto toku genetickej informácie. Pri delení bunky sa vlákna dvojzávitnice DNA, ktorá slúži ako matrica alebo templát, rozvinú a na každom z nich sa pôsobením enzýmov syntetizuje nové komplementárne vlákno. V dôsledku toho sa z jednej materskej molekuly DNA získajú dve úplne identické dcérske molekuly (pozri Bunka, Mitóza).

Aj v prípade hemoglobínu sa ukázalo, že jeho biologická funkcia – schopnosť reverzibilne dodávať kyslík v pľúcach a následne ho podávať tkanivám – úzko súvisí s vlastnosťami trojrozmernej štruktúry hemoglobínu a jeho zmenami v proces plnenia svojej prirodzenej fyziologickej úlohy. Keď sa O2 viaže a disociuje, dochádza k priestorovým zmenám v konformácii molekuly hemoglobínu, čo vedie k zmene afinity atómov železa, ktoré obsahuje, ku kyslíku. Zmeny veľkosti molekuly hemoglobínu, ktoré pripomínajú zmeny objemu hrudníka počas dýchania, umožnili, aby sa hemoglobín nazýval „molekulárne pľúca“.

Jednou z najdôležitejších vlastností živých predmetov je ich schopnosť jemne regulovať všetky prejavy životnej činnosti. Veľký príspevok M. b. vedecké objavy treba považovať za objav nového, predtým neznámeho regulačného mechanizmu, označovaného ako alosterický efekt. Spočíva v schopnosti látok s nízkou molekulovou hmotnosťou – tzv. ligandy - modifikujú špecifické biologické funkcie makromolekúl, primárne katalyticky pôsobiace proteíny - enzýmy, hemoglobín, receptorové proteíny podieľajúce sa na stavbe biologických membrán (Pozri Biologické membrány), pri synaptickom prenose (Pozri Synapsie) atď.

Tri biotické toky. Vo svetle M. myšlienok b. súhrn životných javov možno považovať za výsledok kombinácie troch prúdov: prúdenie hmoty, ktoré nachádza svoje vyjadrenie vo fenoménoch metabolizmu, t. j. asimilácii a disimilácii; prúdenie energie, ktorá je hnacou silou všetkých prejavov života; a tok informácií, prenikajúci nielen do celej rozmanitosti procesov vývoja a existencie každého organizmu, ale aj do súvislého radu po sebe nasledujúcich generácií. Je to myšlienka toku informácií, zavedená do doktríny živého sveta rozvojom biologickej vedy, ktorá v nej zanecháva svoj špecifický, jedinečný odtlačok.

Najvýznamnejšie úspechy molekulárnej biológie. Rýchlosť, rozsah a hĺbka vplyvu M. b. Pokroky v chápaní základných problémov štúdia živej prírody sa právom porovnávajú napríklad s vplyvom kvantovej teórie na rozvoj atómovej fyziky. Tento revolučný vplyv určili dve vnútorne súvisiace podmienky. Na jednej strane rozhodujúcu úlohu zohralo objavenie možnosti štúdia najdôležitejších prejavov životnej činnosti v najjednoduchších podmienkach, približujúcich sa typu chemických a fyzikálnych experimentov. Na druhej strane v dôsledku tejto okolnosti došlo k rýchlemu zapojeniu značného počtu predstaviteľov exaktných vied - fyzikov, chemikov, kryštalografov a potom matematikov - do vývoja biologických problémov. Tieto okolnosti spolu určili nezvyčajne rýchle tempo rozvoja lekárskej vedy a množstvo a význam jej úspechov dosiahnutých len za dve desaťročia. Tu je zďaleka nie úplný zoznam týchto úspechov: objav štruktúry a mechanizmu biologickej funkcie DNA, všetkých typov RNA a ribozómov (pozri Ribozómy) , odhalenie genetického kódu (pozri genetický kód) ; objav reverznej transkripcie (Pozri Transkripcia) , t.j. syntéza DNA na templáte RNA; štúdium mechanizmov fungovania respiračných pigmentov; objav trojrozmernej štruktúry a jej funkčnej úlohy pri pôsobení enzýmov (pozri Enzýmy) , princíp syntézy matrice a mechanizmy biosyntézy bielkovín; odhalenie štruktúry vírusov (Pozri Vírusy) a mechanizmov ich replikácie, primárnej a čiastočne aj priestorovej štruktúry protilátok; izolácia jednotlivých génov , chemická a potom biologická (enzymatická) syntéza génu, vrátane ľudského, mimo bunky (in vitro); prenos génov z jedného organizmu do druhého, vrátane ľudských buniek; rýchlo postupujúce dešifrovanie chemickej štruktúry zvyšujúceho sa počtu jednotlivých proteínov, najmä enzýmov, ako aj nukleových kyselín; detekcia javov „samoorganizácie“ niektorých biologických objektov so zvyšujúcou sa zložitosťou, počnúc molekulami nukleových kyselín až po viaczložkové enzýmy, vírusy, ribozómy atď.; objasnenie alosterických a iných základných princípov regulácie biologických funkcií a procesov.

Redukcionizmus a integrácia. M. b. je posledným stupňom tohto smeru v štúdiu živých objektov, ktorý sa označuje ako „redukcionizmus“, t. j. túžba zredukovať zložité životné funkcie na javy, ktoré sa vyskytujú na úrovni molekúl, a preto je možné ich študovať metódami fyziky a fyziky. chémia. Dosiahnutý M. b. úspechy naznačujú účinnosť tohto prístupu. Zároveň je potrebné vziať do úvahy, že v prirodzených podmienkach v bunke, tkanive, orgáne a celom organizme máme do činenia so sústavami čoraz zložitejšie. Takéto systémy sú tvorené z komponentov nižšej úrovne prostredníctvom ich prirodzenej integrácie do integrity, získania štrukturálnej a funkčnej organizácie a nových vlastností. Preto, keď sa poznatky o vzorcoch dostupných na zverejnenie na molekulárnej a susednej úrovni stávajú detailnejšími, skôr ako M. b. úloha porozumieť mechanizmom integrácie vzniká ako línia ďalšieho vývoja v skúmaní životných javov. Východiskom je tu štúdium síl medzimolekulových interakcií – vodíkových väzieb, van der Waalsových síl, elektrostatických síl a pod. Svojím súhrnom a priestorovým usporiadaním tvoria to, čo možno označiť ako „integračnú informáciu“. Treba to považovať za jednu z hlavných častí už spomínaného toku informácií. V oblasti M. b. Príklady integrácie zahŕňajú fenomén samozostavovania zložitých útvarov zo zmesi ich komponentov. Ide napríklad o tvorbu viaczložkových proteínov z ich podjednotiek, tvorbu vírusov z ich základných častí - proteínov a nukleovej kyseliny, obnovu pôvodnej štruktúry ribozómov po oddelení ich proteínových a nukleových kyselín atď. týchto javov priamo súvisí s poznaním základných javov „rozpoznávanie“ molekúl biopolymérov. Ide o to, zistiť, aké kombinácie aminokyselín - v molekulách proteínov alebo nukleotidov - v nukleových kyselinách navzájom interagujú pri procesoch spájania jednotlivých molekúl s tvorbou komplexov prísne špecifického, vopred určeného zloženia a štruktúry. Patria sem procesy tvorby komplexných proteínov z ich podjednotiek; ďalej selektívna interakcia medzi molekulami nukleových kyselín, napríklad transport a matrica (v tomto prípade odhalenie genetického kódu významne rozšírilo naše informácie); napokon je to tvorba mnohých typov štruktúr (napríklad ribozómov, vírusov, chromozómov), na ktorých sa podieľajú proteíny aj nukleové kyseliny. Objav zodpovedajúcich vzorcov, znalosť „jazyka“, ktorý je základom týchto interakcií, predstavuje jednu z najdôležitejších oblastí matematickej biológie, ktorá stále čaká na svoj rozvoj. Táto oblasť je považovaná za jeden zo základných problémov celej biosféry.

Problémy molekulárnej biológie. Spolu s naznačenými dôležitými úlohami M. b. (poznanie zákonov „uznávania“, sebazostavovania a integrácie) naliehavým smerom vedeckého bádania v blízkej budúcnosti je vývoj metód, ktoré umožnia rozlúštiť štruktúru a následne aj trojrozmernú, priestorovú organizáciu vysokomolekulárne nukleové kyseliny. Toto sa teraz dosiahlo s ohľadom na všeobecný náčrt trojrozmernej štruktúry DNA (dvojitá špirála), ale bez presnej znalosti jej primárnej štruktúry. Rýchly pokrok vo vývoji analytických metód nám umožňuje s istotou očakávať dosiahnutie týchto cieľov v nasledujúcich rokoch. Tu, samozrejme, hlavné príspevky pochádzajú od predstaviteľov príbuzných vied, predovšetkým fyziky a chémie. Všetky najdôležitejšie metódy, ktorých použitie zabezpečilo vznik a úspech molekulárnej biológie, navrhli a vyvinuli fyzici (ultracentrifugácia, röntgenová difrakčná analýza, elektrónová mikroskopia, nukleárna magnetická rezonancia atď.). Takmer všetky nové fyzikálne experimentálne prístupy (napríklad použitie počítačov, synchrotrónu alebo brzdného žiarenia, žiarenia, laserovej technológie atď.) otvárajú nové možnosti pre hĺbkové štúdium problémov molekulárnej biológie. Medzi najdôležitejšie praktické problémy, na ktoré sa očakáva odpoveď od M. b., patrí na prvom mieste problém molekulárnej podstaty malígneho rastu, potom - spôsoby prevencie a možno aj prekonania dedičných chorôb - „molekulárne choroby “ (Pozri Molekulárne choroby). Veľký význam bude mať objasnenie molekulárnej podstaty biologickej katalýzy, teda pôsobenie enzýmov. Medzi najvýznamnejšie moderné trendy v M. b. by mala zahŕňať túžbu rozlúštiť molekulárne mechanizmy pôsobenia hormónov (pozri Hormóny) , toxické a liečivé látky, ako aj zistiť podrobnosti o molekulárnej štruktúre a fungovaní takých bunkových štruktúr, ako sú biologické membrány, ktoré sa podieľajú na regulácii procesov penetrácie a transportu látok. Vzdialenejšie ciele M. b. - znalosť podstaty nervových procesov, pamäťových mechanizmov (Pozri Pamäť) atď. Jedna z dôležitých vznikajúcich častí memorovania. - tzv genetické inžinierstvo, ktorého cieľom je cielene prevádzkovať genetický aparát (Genóm) živých organizmov, od mikróbov a nižších (jednobunkových) až po človeka (v druhom prípade predovšetkým za účelom radikálnej liečby dedičných chorôb (pozri Dedičné choroby) a korekcia genetických defektov). O rozsiahlejších zásahoch do ľudského genetického základu sa dá diskutovať až vo viac-menej vzdialenej budúcnosti, pretože to bude zahŕňať vážne prekážky technického aj základného charakteru. Vo vzťahu k mikróbom, rastlinám a možno aj poľnohospodárskym produktom. Pre zvieratá sú takéto vyhliadky veľmi povzbudivé (napríklad získanie odrôd pestovaných rastlín, ktoré majú zariadenie na fixáciu dusíka zo vzduchu a nevyžadujú hnojivá). Vychádzajú z už dosiahnutých úspechov: izolácia a syntéza génov, prenos génov z jedného organizmu do druhého, využitie masových bunkových kultúr ako producentov ekonomicky alebo medicínsky dôležitých látok.

Organizácia výskumu v molekulárnej biológii. Rýchly rozvoj M. b. viedla k vzniku veľkého počtu špecializovaných výskumných centier. Ich počet rýchlo rastie. Najväčší: vo Veľkej Británii - Laboratórium molekulárnej biológie v Cambridge, Royal Institution v Londýne; vo Francúzsku - ústavy molekulárnej biológie v Paríži, Marseille, Štrasburgu, Pasteurov inštitút; v USA - oddelenia M. b. na univerzitách a inštitútoch v Bostone (Harvard University, Massachusetts Institute of Technology), San Franciscu (Berkeley), Los Angeles (California Institute of Technology), New Yorku (Rockefeller University), zdravotných inštitútoch v Bethesde atď.; v Nemecku - Inštitúty Maxa Plancka, univerzity v Göttingene a Mníchove; vo Švédsku - Karolinska Institutet v Štokholme; v NDR - Ústredný ústav molekulárnej biológie v Berlíne, ústavy v Jene a Halle; v Maďarsku - Biologické centrum v Szegede. V ZSSR prvý špecializovaný ústav lekárskej medicíny. bola vytvorená v Moskve v roku 1957 v systéme Akadémie vied ZSSR (pozri. ); potom vznikli: Ústav bioorganickej chémie Akadémie vied ZSSR v Moskve, Ústav bielkovín v Puščine, Biologické oddelenie Ústavu pre atómovú energiu (Moskva) a oddelenia M. b. v ústavoch Sibírskej pobočky Akadémie vied v Novosibirsku, Medzifakultnom laboratóriu bioorganickej chémie Moskovskej štátnej univerzity, sektore (vtedy Ústav) molekulárnej biológie a genetiky Akadémie vied Ukrajinskej SSR v Kyjeve; významné dielo o M. b. sa uskutočňuje v Ústave makromolekulárnych zlúčenín v Leningrade, v mnohých oddeleniach a laboratóriách Akadémie vied ZSSR a ďalších oddeleniach.

Spolu s jednotlivými výskumnými centrami vznikali organizácie väčšieho rozsahu. V západnej Európe vznikla Európska organizácia pre M. b. (EMBO), na ktorom sa zúčastňuje viac ako 10 krajín. V ZSSR na Ústave molekulárnej biológie bola v roku 1966 vytvorená vedecká rada molekulárnej biológie, ktorá je koordinačným a organizačným centrom v tejto oblasti poznania. Vydal rozsiahlu sériu monografií o najvýznamnejších úsekoch matematiky, pravidelne organizuje „zimné školy“ z matematiky, organizuje konferencie a sympóziá o aktuálnych problémoch matematiky. V budúcnosti budú vedecké rady o M. b. boli vytvorené na Akadémii lekárskych vied ZSSR a mnohých republikových akadémiách vied. Od roku 1966 vychádza časopis Molecular Biology (6 čísel ročne).

Za pomerne krátky čas vyrástla v ZSSR významná skupina výskumníkov v oblasti mikrobiológie; ide o vedcov staršej generácie, ktorí čiastočne zmenili svoje záujmy z iných oblastí; väčšinou ide o početných mladých výskumníkov. Medzi popredných vedcov, ktorí sa aktívne podieľali na formovaní a rozvoji M. b. v ZSSR možno menovať ako A. A. Baev, A. N. Belozersky, A. E. Braunstein, Yu. A. Ovchinnikov, A. S. Spirin, M. M. Shemyakin, V. A. Engelhardt. Nové úspechy M. b. a molekulárna genetika bude presadzovaná uznesením ÚV KSSZ a Rady ministrov ZSSR (máj 1974) „O opatreniach na urýchlenie rozvoja molekulárnej biológie a molekulárnej genetiky a využitie ich úspechov v národnom ekonomika.”

Lit.: Wagner R., Mitchell G., Genetika a metabolizmus, prekl. z angličtiny, M., 1958; Szent-Gyorgy a A., Bioenergetika, prekl. z angličtiny, M., 1960; Anfinsen K., Molekulárne základy evolúcie, trans. z angličtiny, M., 1962; Stanley W., Valens E., Vírusy a povaha života, prekl. z angličtiny, M., 1963; Molekulárna genetika, trans. s. Angličtina, časť 1, M., 1964; Volkenshtein M.V., Molekuly a život. Úvod do molekulárnej biofyziky, M., 1965; Gaurowitz F., Chémia a funkcie proteínov, trans. z angličtiny, M., 1965; Bresler S.E., Úvod do molekulárnej biológie, 3. vydanie, M. - L., 1973; Ingram V., Biosyntéza makromolekúl, trans. z angličtiny, M., 1966; Engelhardt V. A., Molekulárna biológia, v knihe: Rozvoj biológie v ZSSR, M., 1967; Úvod do molekulárnej biológie, prel. z angličtiny, M., 1967; Watson J., Molekulárna biológia génu, trans. z angličtiny, M., 1967; Finean J., Biologické ultraštruktúry, trans. z angličtiny, M., 1970; Bendall J., Svaly, molekuly a pohyb, trans. z angličtiny, M., 1970; Ichas M., Biologický kód, prekl. z angličtiny, M., 1971; Molekulárna biológia vírusov, M., 1971; Molekulové základy biosyntézy proteínov, M., 1971; Bernhard S., Štruktúra a funkcia enzýmov, trans. z angličtiny, M., 1971; Spirin A.S., Gavrilova L.P., Ribosome, 2. vydanie, M., 1971; Frenkel-Konrath H., Chémia a biológia vírusov, prekl. z angličtiny, M., 1972; Smith K., Hanewalt F., Molekulárna fotobiológia. Procesy inaktivácie a obnovy, trans. z angličtiny, M., 1972; Harris G., Základy ľudskej biochemickej genetiky, trans. z angličtiny, M., 1973.

V. A. Engelhardt.

Veľká sovietska encyklopédia. - M.: Sovietska encyklopédia. 1969-1978 .

V krátkosti pripomeniem tzv centrálna dogma molekulárnej biológie, ktorú pôvodne sformuloval Francis Crick. Vo všeobecnosti uvádza, že genetická informácia, keď je implementovaná, sa prenáša z nukleových kyselín do proteínov, ale nie naopak. Presnejšie povedané, je možné preniesť DNA → DNA ( replikácie), DNA → RNA ( prepis) a RNA → proteín ( vysielať). Existujú aj oveľa menej často implementované dráhy charakteristické pre niektoré vírusy: RNA → DNA ( reverzná transkripcia) a RNA → RNA ( replikácia RNA). Ešte pripomeniem, že proteíny sa skladajú z aminokyselinových zvyškov, ktorých poradie je zakódované v genetickom kóde organizmu: tri nukleotidy (tzv. kodón, alebo trojčatá) kóduje jednu aminokyselinu a niekoľko kodónov môže kódovať rovnakú aminokyselinu.

V druhej polovici 20. storočia došlo k rozvoju technológie rekombinantná DNA(čiže metódy manipulácie s DNA, ktoré umožňujú rôznymi spôsobmi meniť sekvenciu a zloženie nukleotidov v molekule). Práve na ich základe sa dodnes vyvíjajú všetky molekulárno-biologické metódy, hoci sa ideovo aj technologicky stali oveľa zložitejšími. Práve molekulárna biológia spôsobila za posledné polstoročie taký rýchly nárast množstva biologických informácií.

Budem hovoriť o metódach manipulácie a štúdia DNA a RNA a veľmi stručne sa dotknem proteínov, pretože metódy s nimi spojené majú vo všeobecnosti bližšie k biochémii ako k molekulárnej biológii (hoci hranica medzi nimi je v poslednej dobe veľmi nejasná).

Strihanie a šitie

Enzýmy sú bielkoviny, ktoré urýchľujú chemické reakcie. Sú veľmi účinné: zrýchlenie môže byť niekoľko rádov! Napríklad enzým kataláza, ktorý štiepi peroxid vodíka, urýchľuje reakciu asi o 12 rádov, teda biliónkrát! Anorganický katalyzátor – jemne rozptýlená platina – zároveň urýchľuje tú istú reakciu len o šesť rádov, čiže miliónkrát. Pre väčšinu z nich je to však za cenu veľmi prísnych prevádzkových podmienok.

Reštrikčné endonukleázy

Obrázok 2. Miesta obmedzenia. Vyššie Sma I, počas ktorého sa vytvárajú „tupé“ konce. Zdola- cieľová sekvencia reštrikčného enzýmu Eco RI, ktorý vytvára „lepivé“ konce.

Jedným z prvých a najdôležitejších krokov v molekulárnej biológii bola schopnosť rezať molekuly DNA, a to na presne definovaných miestach. Táto metóda bola vynájdená pri štúdiu takéhoto javu v 50. – 70. rokoch 20. storočia: niektoré druhy baktérií pri pridávaní cudzej DNA do prostredia ju zničili, pričom ich vlastná DNA zostala nepoškodená. Ukázalo sa, že na to používajú enzýmy, neskôr tzv reštrikčné nukleázy alebo reštrikčné enzýmy. Existuje mnoho typov reštrikčných enzýmov: do roku 2007 ich bolo známych viac ako 3000. Dôležitou vlastnosťou každého takéhoto enzýmu je jeho schopnosť rezať prísne definované - cieľ- sekvencia nukleotidov DNA (obr. 2). Reštrikčné enzýmy neovplyvňujú vlastnú DNA bunky, pretože nukleotidy v cieľových sekvenciách sú modifikované tak, že s nimi reštrikčný enzým nemôže pracovať. (Pravdaže, niekedy, naopak, môžu rezať iba modifikované sekvencie - na boj proti tým, ktorí modifikujú DNA, chránia sa pred vyššie opísanými reštrikčnými enzýmami.) Vzhľadom na skutočnosť, že cieľové sekvencie majú rôznu dĺžku, ich frekvencia výskytu v molekulách DNA sa líši: čím dlhší je požadovaný fragment, tým je menšia pravdepodobnosť má sa objaviť. V súlade s tým budú mať fragmenty DNA vytvorené pri ošetrení rôznymi reštrikčnými enzýmami rôzne dĺžky.

Dodnes sa stále objavujú nové endonukleázy. Mnohé z nich ešte neboli klonované, to znamená, že gény, ktoré ich kódujú, nie sú známe a ako „enzým“ sa používa určitá purifikovaná frakcia proteínov, ktorá má požadovanú katalytickú aktivitu. Novosibirská spoločnosť SibEnzyme dlho úspešne konkurovala spoločnosti New England Biolabs, svetovo uznávanému lídrovi v dodávke reštrikčných enzýmov (to znamená, že ponúkala rovnaké alebo viac rôznych reštrikčných enzýmov, z ktorých niektoré sú veľmi exotické). - Ed.

Na izoláciu prvého reštrikčného enzýmu, štúdium jeho vlastností a ako prvý ho použil na mapovanie chromozómov Werner Arber ( Werner Arber), Dan Nathans ( Dan Nathans) a Hamilton Smith ( Hamilton Smith) získal Nobelovu cenu za fyziológiu alebo medicínu v roku 1978.

DNA ligázy

Na vytvorenie nových molekúl DNA je samozrejme okrem rezania nevyhnutná aj schopnosť zošiť dva vlákna. To sa deje pomocou enzýmov tzv DNA ligázy, ktoré zosieťujú cukrovo-fosfátový hlavný reťazec dvoch reťazcov DNA. Keďže chemická štruktúra DNA sa medzi organizmami nelíši, DNA z akéhokoľvek zdroja sa môže spojiť a bunka nebude schopná rozlíšiť výslednú molekulu od svojej vlastnej DNA.

Separácia molekúl DNA: gélová elektroforéza

Často sa musíte vysporiadať so zmesou molekúl DNA rôznych dĺžok. Napríklad, keď sa DNA chemicky izolovaná z organizmu spracuje reštrikčnými enzýmami, získa sa zmes fragmentov DNA a ich dĺžka sa bude líšiť.

Pretože každá molekula DNA vo vodnom roztoku je negatívne nabitá, je možné oddeliť zmes fragmentov DNA rôznych veľkostí podľa ich dĺžky pomocou elektroforéza, . DNA sa umiestni do gélu (zvyčajne agaróza pre relatívne dlhé a vysoko variabilné molekuly alebo polyakrylamid pre elektroforézu s vysokým rozlíšením), ktorý sa umiestni pod konštantné elektrické pole. Z tohto dôvodu sa molekuly DNA budú pohybovať smerom k pozitívnej elektróde ( anóda), a ich rýchlosti budú závisieť od dĺžky molekuly: čím je dlhšia, tým viac jej gél bráni v pohybe, a teda tým nižšia je rýchlosť. Po elektroforéze tvoria zmesi fragmentov rôznych dĺžok v géli pásy zodpovedajúce fragmentom rovnakej dĺžky. Pomocou markerov (zmesi fragmentov DNA známych dĺžok) možno určiť dĺžku molekúl vo vzorke (obr. 3).

Existujú dva spôsoby vizualizácie výsledkov forézy. Prvým, v poslednom čase najčastejšie používaným, je pridávanie látok do gélu, ktoré fluoreskujú v prítomnosti DNA (tradične sa používal skôr toxický etídium bromid, v poslednej dobe sa začali používať bezpečnejšie látky). Etídiumbromid po ožiarení ultrafialovým svetlom svieti oranžovo a pri naviazaní na DNA sa intenzita žiary zvýši o niekoľko rádov (obr. 4). Ďalšou metódou je použitie rádioaktívnych izotopov, ktoré musia byť najskôr zahrnuté do analyzovanej DNA. V tomto prípade sa na vrch gélu umiestni fotografická platňa, ktorá sa vplyvom rádioaktívneho žiarenia osvetlí nad pruhmi DNA (táto vizualizačná metóda je tzv. autorádiografia).

Obrázok 4. Elektroforéza na agarózovom géli pomocou etídiumbromidu na vizualizáciu výsledkov v ultrafialovom ( vľavo). Druhá stopa zľava je značka so známymi dĺžkami fragmentov. Napravo- Inštalácia pre gélovú elektroforézu.

Okrem „konvenčnej“ elektroforézy na gélovej platni v niektorých prípadoch používajú kapilárna elektroforéza, ktorá sa vykonáva vo veľmi tenkej skúmavke naplnenej gélom (zvyčajne polyakrylamidom). Rozlíšenie takejto elektroforézy je oveľa vyššie: možno ju použiť na oddelenie molekúl DNA, ktoré sa líšia dĺžkou len jeden nukleotid. Prečítajte si o jednej z dôležitých aplikácií tejto metódy v popise Sangerovej metódy sekvenovania DNA nižšie.

Identifikácia špecifickej sekvencie DNA v zmesi. Southern blotting

Pomocou elektroforézy môžete zistiť veľkosť molekúl DNA v roztoku, ale nepovie vám nič o poradí nukleotidov v nich. Používaním hybridizácia DNA môžete pochopiť, ktorý z pásikov obsahuje fragment prísne definované sekvencie. Hybridizácia DNA je založená na tvorbe vodíkových väzieb medzi dvoma vláknami DNA, čo vedie k ich spojeniu.

Najprv musíte syntetizovať DNA sonda, komplementárna k sekvencii, ktorú hľadáme. Zvyčajne ide o jednovláknovú molekulu DNA s dĺžkou 10–1000 nukleotidov. Vďaka komplementarite sa sonda naviaže na požadovanú sekvenciu a vďaka fluorescenčnej značke alebo rádioizotopom zabudovaným do sondy je možné vidieť výsledky.

K tomu použite procedúru tzv Southern blotting alebo Južný transfer, pomenované po vedcovi, ktorý ho vynašiel ( Edwin Southern). Na začiatku sa zmes fragmentov DNA separuje pomocou elektroforézy. Na vrch gélu sa umiestni vrstva nitrocelulózy alebo nylonu a oddelené fragmenty DNA sa na ňu prenesú blotovaním: gél leží na špongii v kúpeli alkalického roztoku, ktorý vďaka kapiláre preniká cez gél a nitrocelulózu. efekt papierových utierok zložených na vrchu. Počas perkolácie alkálie spôsobí denaturáciu DNA a jednovláknové fragmenty sa prenesú na povrch nitrocelulózovej platne a tam sa fixujú. Nitrocelulózová vrstva sa opatrne odstráni z gélu a ošetrí sa rádioaktívne značenou DNA sondou špecifickou pre požadovanú sekvenciu DNA. Nitrocelulózová fólia sa dôkladne umyje tak, aby na nej zostali len tie molekuly vzorky, ktoré hybridizovali s DNA na nitrocelulóze. Po autorádiografii bude DNA, s ktorou sonda hybridizovala, viditeľná ako pásy na fotografickej platni (obr. 5).

Prispôsobenie tejto techniky na detekciu špecifických sekvencií RNA sa na rozdiel od Southern blottingu nazýva Northern blotting: južná v angličtine znamená „južný“ a severný- „severná“). V tomto prípade sa elektroforéza uskutočňuje v géli s molekulami mRNA a ako sonda sa vyberie jednovláknová molekula DNA alebo RNA.

klonovanie DNA

Už vieme, ako rozrezať genóm na kúsky (a spojiť ich s ľubovoľnými molekulami DNA), oddeliť výsledné fragmenty podľa dĺžky a použiť hybridizáciu na výber požadovaného. Teraz je čas naučiť sa, ako kombináciou týchto metód môžeme klonovať časť genómu (napríklad konkrétny gén). V genóme každý gén zaberá extrémne malú dĺžku (v porovnaní s celou DNA bunky). klonovanie DNA doslova znamená vytvorenie veľkého počtu kópií konkrétneho jeho fragmentu. Je to práve vďaka tomu zosilnenie dostaneme možnosť izolovať úsek DNA a získať ho v dostatočnom množstve na štúdium.

Ako oddeliť fragmenty DNA podľa dĺžky a identifikovať požadovaný fragment, bolo opísané vyššie. Teraz musíme pochopiť, ako môžeme skopírovať fragment, ktorý potrebujeme. Existujú dve hlavné metódy: použitie rýchlo sa deliacich organizmov (zvyčajne baktérií Escherichia coli- E. coli - alebo kvasinky Saccharomyces serevisiae) alebo urobte podobný proces, ale in vitro používaním polymerická reťazová reakcia.

Replikácia v baktériách

Keďže baktérie (ako každá iná bunka, nepočítajúc prekurzory zárodočných buniek) zdvojnásobujú svoju DNA pri každom bunkovom delení, možno to použiť na znásobenie počtu potrebné pre nás DNA. Aby sme náš fragment DNA vniesli do baktérie, je potrebné ho „zašiť“ do špeciálneho vektora, ktorý sa zvyčajne používa ako bakteriálny plazmid(malá - v porovnaní s bakteriálnym chromozómom - kruhová molekula DNA, ktorá sa replikuje oddelene od chromozómu). Podobné štruktúry sa často nachádzajú v baktériách „divokého typu“: často sa prenášajú „horizontálne“ medzi rôznymi kmeňmi alebo dokonca druhmi baktérií. Najčastejšie obsahujú gény pre rezistenciu voči antibiotikám (práve pre túto vlastnosť boli objavené) alebo bakteriofágy a tiež gény, ktoré bunke umožňujú využívať rôznorodejší substrát. (Niekedy sú „sebecké“ a nevykonávajú žiadne funkcie.) Práve tieto plazmidy sa zvyčajne používajú v molekulárno-genetických štúdiách. Plazmidy nevyhnutne obsahujú počiatok replikácie (sekvencia, z ktorej replikácia molekuly začína), sekvenciu cieľového reštrikčného enzýmu a gén, ktorý umožňuje selekciu tých buniek, ktoré tento plazmid vlastnia (zvyčajne sú to gény pre rezistenciu na niektoré antibiotiká) . V niektorých prípadoch (napríklad pri štúdiu veľmi veľkých fragmentov DNA) sa nepoužíva plazmid, ale umelý bakteriálny chromozóm.

Požadovaný fragment DNA sa vloží do plazmidu pomocou reštrikčných enzýmov a ligáz, potom sa pridá do bakteriálnej kultúry za špeciálnych podmienok, ktoré zabezpečia transformácia- proces aktívneho zachytávania DNA baktériami z vonkajšieho prostredia (obr. 6). Potom sa selektujú baktérie, ktorých transformácia bola úspešná, pridaním antibiotika zodpovedajúceho génu v plazmide: nažive zostanú iba bunky nesúce gén rezistencie (a následne plazmid). Potom, čo bunková kultúra vyrástla, sa z nej izolujú plazmidy a z nich sa izoluje „náš“ fragment DNA pomocou reštrikčných enzýmov (alebo pomocou celého plazmidu). Ak je gén vložený do plazmidu, aby sa získal jeho proteínový produkt, je potrebné poskytnúť kultúre podmienky pre rast a potom jednoducho izolovať požadovaný proteín.

V tomto bode by mala okamžite vyvstať otázka: ako bolo možné toto všetko použiť predtým, ako sa podarilo rozlúštiť genómy a čítanie sekvencie DNA bolo stále drahé a zriedkavé? Predpokladajme, že pomocou obmedzenia a klonovania získame výsledné fragmenty DNA knižnica, teda súbor baktérií nesúcich rôzne plazmidy obsahujúce celý genóm (alebo jeho významnú časť). Ale ako môžeme zistiť, ktorý fragment obsahuje požadovaný gén? Na tento účel sa použila metóda hybridizácie. Najprv bolo potrebné izolovať proteín požadovaného génu. Potom sekvenujte jeho fragment, zmeňte genetický kód a získajte nukleotidovú sekvenciu (samozrejme, kvôli degenerácii genetického kódu sme museli vyskúšať veľa rôznych možností). V súlade s ním bola chemicky syntetizovaná krátka molekula DNA, ktorá bola použitá ako sonda na hybridizáciu.

Ale v niektorých prípadoch táto metóda zlyhala - napríklad sa to stalo s faktorom zrážanlivosti krvi VIII. Tento proteín sa podieľa na zrážaní krvi a abnormality v jeho funkčnosti sú príčinou jedného z najčastejších genetických ochorení – hemofílie A. Predtým sa pri liečbe musel tento proteín izolovať z veľkého množstva organizmov, pretože ho nebolo možné klonovať na produkciu baktériami. Bolo to spôsobené tým, že jeho dĺžka je asi 180 000 nukleotidových párov a obsahuje veľa intrónov (nekódujúcich fragmentov medzi kódujúcimi fragmentmi) - nie je prekvapujúce, že tento gén nebol úplne obsiahnutý v žiadnom plazmide.

Mechanizmy zrážania krvi, pozri „ Ako funguje zrážanie krvi? ». - Ed.

Polymerázová reťazová reakcia (PCR)

Metóda je založená na opakovanom selektívnom kopírovaní určitého úseku DNA pomocou enzýmov v umelých podmienkach. V tomto prípade sa skopíruje iba časť DNA, ktorá spĺňa špecifikované podmienky, a to iba vtedy, ak je prítomná v skúmanej vzorke. Na rozdiel od replikácie DNA v bunkách živých organizmov, PCR amplifikuje relatívne krátke úseky DNA (zvyčajne nie viac ako 3 000 nukleotidových párov, ale existujú metódy, ktoré umožňujú „získať“ až 20 000 nukleotidových párov – tzv. Long Range PCR).

V skutočnosti je PCR umelá viacnásobná replikácia fragmentu DNA (obr. 7). DNA polymerázy sú navrhnuté takým spôsobom, že nemôžu syntetizovať novú DNA jednoducho tým, že majú templát a monoméry. To tiež vyžaduje semeno ( základný náter), z ktorých začínajú syntézu. Primér je krátky jednovláknový fragment nukleovej kyseliny, ktorý je komplementárny k templátu DNA. Počas replikácie v bunke sú takéto priméry syntetizované špeciálnym enzýmom prvoradý a sú to molekuly RNA, ktoré sú neskôr nahradené DNA. PCR však používa umelo syntetizované molekuly DNA, pretože v tomto prípade nie je potrebná fáza odstránenia RNA a syntézy DNA na jej mieste. V PCR priméry obmedzujú oblasť, ktorá sa má amplifikovať na oboch stranách.

Obrázok 7. Replikácia DNA- najdôležitejší proces pre živé organizmy, základ mnohých molekulárno-biologických metód. Keďže každý z reťazcov DNA obsahuje sekvenciu nukleotidov komplementárnych k druhému reťazcu (ich informačný obsah je rovnaký), pri zdvojení DNA sa reťazce rozchádzajú a potom každý reťazec slúži ako templát, na ktorom sa vytvorí nový reťazec DNA komplementárny je postavená. V dôsledku toho sa vytvoria dva duplexy DNA, z ktorých každý je presnou (bez zohľadnenia chýb syntézy) kópiou pôvodnej molekuly.

Takže je čas vysvetliť, ako PCR funguje. Na začiatku reakčná zmes obsahuje: templát DNA, priméry, DNA polymerázu, voľné nukleozidy (budúce „písmená“ v novosyntetizovanej DNA), ako aj niektoré ďalšie látky, ktoré zlepšujú fungovanie polymerázy (pridávajú sa do špeciálnych pufrov používaných v reakcia).

Aby sa syntetizovala DNA komplementárna k templátu, je potrebné, aby s ním jeden z primérov vytvoril vodíkové väzby (ako sa hovorí, „aneloval“). Ale matrica ich už tvorí s druhým reťazcom! To znamená, že DNA sa musí najskôr roztaviť, to znamená, že sa musia zničiť vodíkové väzby. A to jednoduchým ohrevom (na ≈95 °C) – etapa tzv denaturácia. Ale teraz, kvôli vysokej teplote, ani priméry nemôžu priľnúť k matrici! Potom sa teplota zníži (50–65 °C), priméry sa vyžíhajú, potom sa teplota mierne zvýši (na optimum polymerázy, zvyčajne okolo 72 °C). A potom polymeráza začne syntetizovať reťazce DNA komplementárne s matricou - to sa nazýva predĺženie(obr. 8). Po jednom takomto cykle sa počet kópií požadovaných fragmentov zdvojnásobil. Nič vám však nebráni zopakovať si to znova. A nie len raz, ale hneď niekoľko desiatok krát! A s každým opakovaním sa počet kópií nášho fragmentu DNA zdvojnásobí, pretože novosyntetizované molekuly budú slúžiť aj ako šablóny (obr. 9)! (V skutočnosti je účinnosť PCR zriedka taká vysoká, že počet kópií je presný štvorhra, ale v ideálnom prípade je to tak a reálne čísla sa tomu často približujú.)

Obrázok 9. S každým cyklom PCR sa množstvo cieľovej DNA zdvojnásobí.

Vidieť výsledky PCR je veľmi jednoduché: stačí vykonať elektroforézu reakčnej zmesi po PCR a bude viditeľný jasný pás so získanými kópiami.

Predtým bolo potrebné neustále pridávať polymerázu, ktorá sa inaktivovala zahrievaním pri každom cykle, ale čoskoro sa navrhlo použiť termostabilnú polymerázu z termofilných baktérií, ktoré takéto zahrievanie znesú, čo značne zjednodušilo PCR (najčastejšie Taq polymeráza z baktérie sa používa Thermus aquaticus ).

Aby ste sa vyhli silnému odparovaniu vody z reakčnej zmesi, pridajte olej, ktorý ju zakryje navrchu, a/alebo použite vyhrievané veko termocykler- zariadenie, v ktorom sa vykonáva PCR. Rýchlo mení teplotu skúmaviek a nemusia sa neustále prenášať z jedného termostatu do druhého. Aby som predišiel nešpecifickej syntéze ešte pred zahriatím a samotným začiatkom cyklov, často používam „hot start“ PCR: všetka DNA a polymeráza sú od seba oddelené parafínovou vrstvou, ktorá sa topí pri vysokej teplote a umožňuje im interakciu pod vplyvom správne podmienky. Niekedy sa používajú modifikované polymerázy, ktoré nefungujú pri nízkych teplotách.

O rôznych zložitostiach PCR môžeme hovoriť oveľa viac, ale najdôležitejšie je hovoriť o metódach určovania výsledkov, ktoré sú alternatívou klasickej forézy. Napríklad celkom samozrejmou možnosťou je pridanie látok, ktoré fluoreskujú v prítomnosti DNA, do reakčnej skúmavky pred začatím reakcie. Potom porovnaním počiatočnej fluorescencie s konečnou fluorescenciou je možné zistiť, či bolo syntetizované významné množstvo DNA alebo nie. Ale táto metóda nie je špecifická: nebudeme môcť žiadnym spôsobom určiť, či bola syntetizovaná nevyhnutné fragment alebo niektoré priméry sa zlepili a vytvorili nepredvídateľné sekvencie.

Najzaujímavejšou možnosťou je real-time PCR. Existuje niekoľko implementácií tejto metódy, ale myšlienka je všade rovnaká: môžete priamo sledovať akumuláciu produktov PCR (fluorescenciou) počas reakcie. Preto na vykonanie PCR v reálnom čase potrebujete špeciálne zariadenie schopné vyvolať a čítať fluorescenciu v každej skúmavke. Najjednoduchším riešením je pridať do skúmavky tie isté látky, ktoré fluoreskujú v prítomnosti DNA, nevýhody tejto metódy však už boli opísané vyššie.

Toto sa striktne nazýva „fluorescenčná PCR v reálnom čase“ alebo „kvantitatívna PCR“. - Ed.

Obrázok 11. Príklad kriviek akumulácie fluorescencie v real-time PCR: závislosť intenzity fluorescencie (vo viacerých skúmavkách - každá s vlastnou krivkou) od čísla cyklu.

Najpopulárnejšou implementáciou tohto prístupu je metóda uvoľňovania fluorofóru v dôsledku deštrukcie sondy (TaqMan Assay; Obr. 10). V tomto prípade musí reakčná zmes obsahovať ešte jednu zložku - špeciálnu jednovláknovú DNA sondu: molekulu DNA komplementárnu k sekvencii lokalizovaného amplifikovaného fragmentu. medzi primery. V tomto prípade musí byť jeden koniec chemicky pripevnený fluorofor(fluorescenčná molekula) a na druhú - zhášač (molekula, ktorá absorbuje energiu fluorofóru a „zháša“ fluorescenciu). Keď je takáto sonda v roztoku alebo komplementárne naviazaná na cieľovú sekvenciu, fluorofór a zhášač sú relatívne blízko seba a nepozoruje sa žiadna fluorescencia. Avšak kvôli 3´-exonukleázovej aktivite, ktorú Taq polymeráza má (to znamená, že štiepi DNA, do ktorej počas syntézy „narazí“ a na jej mieste syntetizuje novú), sa sonda pri syntéze druhého vlákna zničí. fluorofór a zhášač v dôsledku difúzií sa od seba vzdialia a objaví sa fluorescencia.

Keď sa počet kópií počas PCR exponenciálne zvyšuje, zvyšuje sa aj fluorescencia. To však netrvá dlho, keďže v určitom momente začne účinnosť reakcie klesať v dôsledku postupnej inaktivácie polymerázy, nedostatku niektorých zložiek a pod. (obr. 11). Analýzou grafov rastu fluorescencie môžete veľa pochopiť o postupe PCR, ale čo je najdôležitejšie, môžete zistiť, koľko templátov DNA bolo pôvodne: ide o tzv. kvantitatívna PCR(kvantitatívna PCR, qPCR).

Nie je možné vymenovať všetky aplikácie PCR vo vede. Izolácia fragmentu DNA, sekvenovanie, mutagenéza... PCR je jednou z najpopulárnejších metód na nevedecké účely (video 1). Je široko používaný v medicíne na včasnú diagnostiku dedičných a infekčných chorôb, určenie otcovstva, pri vyšetrovaní totožnosti a mnoho ďalších.

Prirodzené bunkové procesy in vitro

Všetky základné molekulárne biologické procesy sa dajú ľahko uskutočniť in vitro(to znamená in vitro). Príklad je uvedený vyššie: PCR je analógom replikácie DNA. Za týmto účelom jednoducho zmiešajte potrebné činidlá za vhodných podmienok: na transkripciu potrebujete templát DNA, RNA polymerázu a ribonukleotidy, na transláciu - mRNA, ribozomálne podjednotky a aminokyseliny, na reverznú transkripciu - templát RNA, reverznej transkriptázy(aka reverzná) a deoxyribonukleotidy. Tieto metódy sú široko používané v rôznych oblastiach biológie, keď je potrebné napríklad získať čistú RNA určitého génu. V tomto prípade musíte najprv reverzne prepísať jeho (génovú) mRNA, amplifikovať ju pomocou PCR a potom použiť in vitro- transkripcie, aby sa vytvorilo veľa mRNA. Prvá fáza je nevyhnutná vzhľadom na to, že pred tvorbou zrelej mRNA v bunke, spájanie A spracovanie RNA (v eukaryotoch; v baktériách je v tomto zmysle všetko jednoduchšie) - príprava na prácu ako matrica na syntézu proteínov. Niekedy sa tomu dá vyhnúť, ak sa celá kódujúca sekvencia génu nachádza v jednom exóne.

Sekvenovanie DNA

Dá sa povedať, že najdôležitejšie metódy manipulácie s DNA už boli popísané. Ďalšou fázou je určenie aktuálnej nukleotidovej sekvencie reťazca v molekule - sekvenovanie. Určenie nukleotidovej sekvencie DNA je mimoriadne dôležité pre mnohé základné a aplikované problémy. Vo vede zaujíma osobitné miesto: na analýzu výsledkov sekvenovania genómu bola v skutočnosti vytvorená nová veda - bioinformatika. Sekvenovanie teraz používajú molekulárni biológovia, genetici, biochemici, mikrobiológovia, botanici a zoológovia a, samozrejme, evolucionisti: na jeho výsledkoch je založená takmer celá moderná taxonómia. Sekvenovanie je široko používané v medicíne ako metóda na vyhľadávanie dedičných chorôb a štúdium infekcií. (Pozri napr. Objasnenie „rodokmeňa“ článkonožcov"A" Skutočný vtip: černoch, Číňan a Craig Venter... ». - Ed.)

V skutočnosti boli chronologicky metódy vynájdené v úplne inom poradí. Napríklad Sangerovo sekvenovanie bolo vyvinuté v roku 1977 a PCR, ako je uvedené vyššie, až v roku 1983.

Existuje mnoho rôznych techník sekvenovania, ale všetky metódy možno rozdeliť do dvoch kategórií: „klasické“ a nové generácie. V súčasnosti sa v skutočnosti používa iba jedna „klasická“ metóda - Sangerovo sekvenovanie alebo terminátorová metóda. Oproti novým metódam má dôležitú výhodu: čítacia dĺžka, teda počet nukleotidov v sekvencii, ktoré je možné naraz získať, je vyššia – až 1000 nukleotidov. Zároveň „dobrá“ „nová“ metóda sekvenovania v tomto ohľade - 454- alebo pyrosekvenovanie - má tento parameter nepresahujúci 500 nukleotidov. Práve čítacia dĺžka limituje možnosti nových metód: ukazuje sa, že je mimoriadne ťažké „poskladať“ celý genóm z fragmentov o veľkosti niekoľkých desiatok nukleotidov. To si vyžaduje minimálne superpočítače a niektoré miesta v genóme je jednoducho nemožné vyriešiť, ak obsahujú vysoko sa opakujúce sekvencie. V tomto prípade môže pomôcť porovnanie získaných fragmentov s už existujúcim celým genómom, ale takto je nemožné prečítať genóm organizmu na prvýkrát ( de novo). (Pozri tiež: " Kód života: čítanie neznamená porozumenie ». - Ed.)

Anglický biochemik a významný predstaviteľ molekulárnej biológie, dvojnásobný nositeľ Nobelovej ceny za chémiu: za určenie sekvencie aminokyselín inzulínu (1955) a za vývoj metódy sekvenovania DNA (1980). - Ed.

Existuje metóda novej generácie, ktorá umožňuje čítať niekoľko tisíc bp, ale s veľkými chybami (Pacific Biosciences). 454/Roche dnes dokáže čítať viac ako 500 mon; Mladé „sekvenovanie polovodičov“ už dokáže to isté. - Ed.

Obidve vyššie spomenuté metódy sekvenovania už boli dostatočne podrobne opísané o „biomolekule“: Dôrazne vám odporúčam, aby ste si ju prečítali. Ako príklad vám poviem o ďalšej bežnej rýchlej a lacnej metóde (na prečítanie nukleotidu) - metóde implementovanej v sekvenátoroch Illumina (video 2). Jeho hlavnou nevýhodou je čítanie fragmentov veľmi krátkej dĺžky, nie viac ako 100 nukleotidov, az toho vyplývajúce ťažkosti pri čítaní genómu „od začiatku“.

Túto metódu možno rozdeliť do troch etáp: príprava knižnice fragmentov (1), tvorba zhlukov (2) a samotné sekvenovanie (3).

Video 2. Na internete je niekoľko dobrých videí, ktoré popisujú proces sekvenovania Illumina, napríklad na oficiálnej webovej stránke spoločnosti (záložka Technológia). Pravda, všetky sú v angličtine.

O metódach práce s nukleovými kyselinami a ich štúdiu sa toho už popísalo pomerne veľa. Je načase zistiť, ako môžeme prísť na to, ako bunka funguje – najmä sa pokúsiť určiť funkciu génu a proteínu, ktorý kóduje.

In vitro-mutagenéza

Na štúdium funkcie proteínu je veľmi dôležité naučiť sa ho zavádzať mutácie. Napríklad, ak máte organizmus s nefunkčným enzýmom, môžete použiť biochemické rozdiely, aby ste pochopili, čo robí normálny proteín. Existujú rôzne spôsoby, ako vytvoriť úplne nefunkčný gén (buď ľubovoľný z celého genómu alebo úplne špecifický - potom je to tzv. Knock Out tento gén). Jednou z týchto metód je vloženie nejakého fragmentu DNA do genómu: ak k tejto inzercii dôjde na géne, potom tento (presnejšie povedané, s najväčšou pravdepodobnosťou proteín, ktorý kóduje) prestane normálne fungovať.

Existujú však spôsoby, ako veľmi presne zmeniť sekvenciu génu a teda aj proteínu. O jednej z týchto metód - miestne cielená mutagenéza- Poviem ti. Jeho podstata spočíva v zmene konkrétneho (zvyčajne jedného) nukleotidu v sekvencii. Aby ste ho mohli použiť, musíte najprv naklonovať gén do plazmidu. Potom musíte vykonať určitý druh PCR s jedným primérom. Navyše tento primér musí presne obsahovať sekvenciu, ktorú chceme zmeniť – už vo forme, ktorú potrebujeme. Napríklad na obr. 14 namiesto písmena A, ktoré by malo byť oproti T v rodičovskom reťazci, primér obsahuje C. Po syntéze druhého vlákna DNA plazmidu obsahujúceho primér sa do neho zavedie mutácia - A sa nahradí pomocou C. Takéto plazmidy sa zavádzajú do buniek, v ktorých po delení skončia dva reťazce v rôznych dcérskych bunkách. Polovica potomkov bude mať teda pôvodnú verziu plazmidu a polovica bude mať mutantnú verziu. Potom bude polovica buniek produkovať normálny proteín kódovaný týmto génom a polovica bude produkovať mutantný proteín. V prípade znázornenom na obr. 14, namiesto jednej aminokyseliny (asparagín) bude iná (alanín). Analogicky môžete zaviesť náhodné mutácie pomocou špeciálnej DNA polymerázy, ktorá prináša zvýšený počet chýb.

Obrázok 14. Schéma miestne špecifickej mutagenézy.C. elegans, - teda o vypnutí génu vo všetkých (takmer) bunkách tohto červa.

Tento úžasný účinok sa dosahuje zavedením molekúl dvojvláknovej RNA (dsRNA) do bunky, pričom jeden z reťazcov v každom z nich je komplementárny k časti mRNA „vypnutého“ génu. To otvára vzrušujúce príležitosti na štúdium funkcie génov. Predtým bolo na vypnutie génov potrebné vytvoriť „knokautované“ zvieratá (čo sú vedci stále nútení robiť napríklad s myšami – pozri „ Nobelova cena za fyziológiu a medicínu udelená za technológiu vyraďovania myší ». - Ed.), v ktorom je skúmaný gén v podstate chýba v genóme. Vytvorenie knockoutov je však dosť ťažké a v takýchto organizmoch už nie je možné gén znova zapnúť. Pomocou RNA interferencie je veľmi ľahké vypnúť gén, rovnako ako ho zapnúť tým, že prestanete zavádzať zodpovedajúcu dsRNA do tela.

Existujú tri hlavné spôsoby zavedenia dsRNA do tela. Najzrejmejším je vstreknutie ich roztoku do zvieraťa. Používajú tiež „namáčanie“ háďatiek v roztoku RNA. Ukázalo sa však, že všetko môžete urobiť oveľa jednoduchšie: kŕmiť týmito molekulami háďatká! Obzvlášť výhodné je, že to funguje rovnako dobre, ak sú háďatká kŕmené baktériami ( E. coli), pri syntéze týchto dsRNA (obr. 15).

Obrázok 15. Systémová interferencia RNA.Červ C. elegans exprimuje zeleno fluorescenčný (žiariaci) proteín v bunkách hltana (ph) a svaloch steny tela (bm). Vľavo- originálny vzhľad. Napravo- počas RNA interferencie je gén inaktivovaný „živiacimi“ baktériami.

V zásade je celkom prekvapivý fakt, že molekuly RNA z čreva sa šíria takmer do všetkých tkanív. Je známe, že proteínový kanál je zodpovedný za vstup molekúl RNA do črevných buniek. sid-1, . Nie je však spoľahlivo známe, ako sa RNA šíri po tele červa; s najväčšou pravdepodobnosťou za účasti bielkovín rsd-8 Je zaujímavé, že všetky známe proteíny zapojené do systémovej RNA interferencie v C. elegans, sú prítomné aj u ľudí, ale takýto účinný systém umelého potlačenia aktivity génov na systémovej úrovni nie je možné u ľudí pozorovať. Ak by bolo možné použiť systémovú interferenciu RNA u ľudí, mohla by to byť metóda boja proti obrovskému spektru chorôb, od prechladnutia až po rakovinu.

Mimochodom, použitie RNA interferencie špecificky v kultúre ľudských buniek umožnilo odhaliť veľa ľudských génov prispieť vývoj vírusu chrípky: " Molekulárne dvojité pôsobenie: ľudské gény pracujú na víruse chrípky ». - Ed.

Štúdie génovej expresie: DNA mikročipy

Pri štúdiu funkcie génu je veľmi dôležité zistiť, kedy a v akých tkanivách tela funguje (je exprimovaný), ako aj spolu s akými ďalšími génmi. Ak potrebujete zistiť malý počet génov a tkanív, môžete to urobiť veľmi jednoducho: izolujte RNA z tkaniva, vykonajte reverznú transkripciu (to znamená syntetizujte cDNA - komplementárna DNA) a potom vykonajte kvantitatívnu PCR. Podľa toho, či bola vykonaná PCR, zistíme, či je v tkanive prítomná mRNA skúmaného génu.

Ak je však potrebné urobiť to isté pre mnohé tkanivá a mnohé gény, potom sa táto technika stáva veľmi dlhou a drahou. V tomto prípade použite DNA mikročipy. Sú to malé doštičky, na ktoré sa aplikujú a prichytia molekuly DNA, komplementárne k RNA skúmaných génov, a vopred sa vie, kde sa na nich (doštičkách) ktorá molekula nachádza. Jedným zo spôsobov, ako vytvoriť čip, je syntetizovať molekuly DNA priamo na ňom pomocou robota.

Na štúdium génovej expresie pomocou čipov je tiež potrebné syntetizovať ich cDNA a označiť ju fluorescenčným farbivom (bez separácie cDNA rôznych génov). Táto zmes sa aplikuje na mikročip, čím sa zabezpečí, že cDNA hybridizuje s molekulami DNA na čipe. Potom sa pozrú na miesto, kde sa pozoruje fluorescencia, a porovnajú to s umiestnením molekúl DNA na čipe. Ak sa umiestnenie fluorescencie zhoduje s polohou molekuly DNA, potom je tento gén exprimovaný v tomto tkanive. Okrem toho, označením cDNA z rôznych tkanív rôznymi farbivami môžete študovať expresiu niekoľkých (zvyčajne nie viac ako 2) tkanív na jednom čipe: podľa farby fluorescencie môžete určiť, v ktorom tkanive je exprimovaná (ak vo viacerých naraz získate zmiešanú farbu) (obr. 16).

V poslednom čase sa však namiesto čipov čoraz viac využíva hromadné sekvenovanie celej cDNA z tkaniva (vytváranie tzv. prepisy), ktorý bol značne zjednodušený vďaka vývoju metód sekvenovania. Ukázalo sa, že je to lacnejšie a efektívnejšie, pretože poznanie úplných sekvencií všetkých mRNA poskytuje viac informácií než len fakt o ich prítomnosti alebo neprítomnosti.

Zopakovali sme si základné metódy molekulárnej biológie. Dúfam, že je vám trochu jasnejšie, ako sa robí molekulárno-biologický výskum, za čo sa udeľujú Nobelove ceny a ako môže pomôcť v niektorých aplikovaných problémoch. Predovšetkým však dúfam, že ste tiež videli krásu myšlienok, ktoré sa za nimi skrývajú, a možno ste sa chceli dozvedieť viac o niektorých z týchto techník.

Literatúra

1. Laureáti Nobelovej ceny: J. Watson, F. Crick, M. Wilkins, Wikipedia: 454-sekvenovanie (vysokovýkonné pyrosekvenovanie DNA). Cold Spring Harbor Symposia o kvantitatívnej biológii. 71 , 95-100.

1 otázka. Účel, ciele a metódy molekulárnej biológie. Samotný termín „molekulárna biológia“ bol prvýkrát použitý v angličtine. vedca W. Astburyho k výskumu súvisiacemu s objasnením vzťahov medzi molekulárnou štruktúrou a fyzikálnymi a biologickými vlastnosťami fibrilárnych (vláknitých) proteínov, ako je kolagén, krvný fibrín alebo svalové kontraktilné proteíny. Pojem „molekulárna biológia“ sa široko používa od začiatku 50. rokov. 20. storočie Molekulárna biológia je komplex biologických vied, ktoré študujú mechanizmy ukladania, prenosu a implementácie genetickej informácie, štruktúru a funkcie nepravidelných biopolymérov (proteínov a nukleových kyselín). William Thomas Astbury () britský fyzik, molekulárny biológ

Molekulárna biológia študuje základné vlastnosti a prejavy života na molekulárnej úrovni. Zisťuje, ako a do akej miery je rast a vývoj organizmov, ukladanie a prenos dedičných informácií, premena energie v živých bunkách a iné javy podmienené štruktúrou a vlastnosťami biologicky dôležitých makromolekúl (hlavne bielkovín a nukleových kyselín) . Charakteristickým rysom molekulárnej biológie je štúdium životných javov na neživých predmetoch alebo takých predmetoch, ktoré sa vyznačujú najprimitívnejšími prejavmi života. Sú to biologické útvary z bunkovej úrovne a nižšie: subcelulárne organely, ako sú izolované bunkové jadrá, mitochondrie, ribozómy, chromozómy, bunkové membrány; potom systémy, ktoré stoja na hranici živej a neživej prírody, vírusy vrátane bakteriofágov a končiac molekulami najdôležitejších zložiek živej hmoty, nukleovými kyselinami.

Predmetom výskumu MB sú mechanizmy uchovávania, prenosu a implementácie genetickej informácie, štruktúra a funkcie nepravidelných biopolymérov Predmetom výskumu MB sú subcelulárne vírusy organel (bakteriofágy). jadro mitochondrie ribozómy chromozómové systémy, ktoré stoja na hranici medzi živou a neživou prírodou

Úlohy molekulárnej biológie Hľadanie riešenia problému molekulárnej podstaty malígneho rastu Spôsoby prevencie a prekonania dedičných chorôb Objasnenie molekulárnej podstaty biologickej katalýzy, t.j. pôsobenia enzýmov Dešifrovanie molekulárnych mechanizmov účinku hormónov, toxických a liečivé látky objasnenie detailov molekulárnej štruktúry a fungovania biologických membrán podieľajúcich sa na regulačných procesoch penetrácie a transportu látok Vzdialenejšie úlohy - poznanie podstaty nervových procesov, pamäťových mechanizmov

Vo svetle koncepcií molekulárnej biológie možno život považovať za výsledok kombinácie troch tokov: tok hmoty, ktorý nachádza svoje vyjadrenie vo fenoménoch metabolizmu, t. j. asimilácii a disimilácii; prúdenie energie, ktorá je hnacou silou všetkých prejavov života; tok informácií, ktorý preniká nielen celou rozmanitosťou procesov vývoja a existencie každého organizmu, ale aj nepretržitým radom po sebe nasledujúcich generácií. Je to myšlienka toku informácií, zavedená do doktríny živého sveta rozvojom molekulárnej biológie, ktorá v nej zanecháva svoj špecifický, jedinečný odtlačok.

Molekulárna biológia je posledným stupňom tohto smeru v štúdiu živých objektov, ktorý sa nazýva „redukcionizmus“, t. j. túžba zredukovať zložité životné funkcie na javy, ktoré sa vyskytujú na molekulárnej úrovni, a preto sú prístupné na štúdium pomocou metód fyzika a chémia. Pokroky dosiahnuté v molekulárnej biológii naznačujú účinnosť tohto prístupu. Zároveň je potrebné vziať do úvahy, že v prirodzených podmienkach sú bunka, tkanivo, orgán a celý organizmus sústavami s narastajúcou zložitosťou. Tieto systémy sú tvorené z komponentov nižšej úrovne ich integráciou do celku, ktorý získava nové vlastnosti.

Metódy molekulárnej biológie. Keďže molekulárna biológia je komplex biologických vied, využíva metódy týchto vied: ultracentrifugácia, röntgenová difrakčná analýza, elektrónová mikroskopia, nukleárna magnetická rezonancia, polymerázová reťazová reakcia. Okrem toho molekulárna biológia využíva metódy iných vied – napríklad fyziky: využitie počítačov, synchrotrón, čiže brzdné žiarenie, žiarenie, laserové technológie.

Elektrónová mikroskopia Elektrónový mikroskop je zariadenie, ktoré umožňuje získať obrazy objektov s maximálnym miliónovým zväčšením vďaka použitiu, na rozdiel od optického mikroskopu, elektrónového lúča namiesto svetelného toku. Na získanie obrázkov v elektrónovom mikroskope sa používajú špeciálne magnetické šošovky na riadenie pohybu elektrónov v stĺpci prístroja pomocou magnetického poľa.

Fluorescenčná (luminiscenčná) mikroskopia je založená na schopnosti niektorých látok luminiscovať, teda žiariť pri osvetlení neviditeľným ultrafialovým alebo modrým svetlom. Keď je luminiscencia excitovaná modrým svetlom, jej farba sa môže pohybovať od zelenej po červenú; ak je luminiscencia excitovaná ultrafialovým žiarením, potom môže byť luminiscencia v ktorejkoľvek časti viditeľného spektra. Konštrukcia fluorescenčného mikroskopu a pravidlá práce s ním sa líšia od mikroskopu s prechádzajúcim svetlom v týchto skutočnostiach: Prítomnosť výkonného svetelného zdroja v iluminátore, ktorý vyžaruje prevažne v krátkovlnnej (ultrafialovej, modrej) časti spektra. (ultravysokotlaková ortuťovo-kremenná výbojka alebo halogénová kremenná výbojka). Dostupnosť systému svetelných filtrov: 1. vzrušujúce svetelné filtre prepúšťajú len tú časť spektra, ktorá budí luminiscenciu; 2. Tepelne ochranný svetelný filter chráni ostatné svetelné filtre, preparát a optiku fluorescenčného mikroskopu pred prehriatím. 3. „uzamykacie“ filtre sú umiestnené medzi okulárom. Tieto filtre absorbujú vzrušujúce žiarenie a prenášajú luminiscenčné svetlo z liečiva do oka pozorovateľa.

Odstreďovanie Odstreďovanie je separácia heterogénnych systémov (napr. častice kvapalina-pevná látka) na hustotné frakcie pomocou odstredivých síl. Centrifugácia sa vykonáva v strojoch nazývaných centrifúgy. Centrifúga je zariadenie, ktoré vytvára vysoké odstredivé sily otáčaním rotora od 200 otáčok za minútu do otáčok za minútu. Centrifugácia v biológii sa používa na oddelenie sedimentu bunkových štruktúr z roztoku. Na štúdium vysokomolekulárnych látok (proteíny, nukleové kyseliny a pod.) a biologických systémov sa používajú ultracentrifúgy s otáčkami rotora od 2000 ot./min. do ot./min. (do 2500 ot./min.).

Elektroforéza Elektroforéza je pohyb častíc dispergovanej fázy koloidných alebo proteínových roztokov v kvapalnom alebo plynnom prostredí pod vplyvom vonkajšieho elektrického poľa. Prvýkrát ho objavili profesori Moskovskej univerzity P.I.Strachov a F.F.Reiss v roku 1809. V biológii sa elektroforéza používa na separáciu makromolekúl.

Polymerázovú reťazovú reakciu (PCR) vynašiel v roku 1983 americký vedec Kary Mullis. Za tento vynález následne dostal Nobelovu cenu. Metóda PCR je založená na opakovanom zdvojení špecifického úseku DNA. Výsledkom je produkcia dostatočného množstva DNA na vizuálnu detekciu. Molekulárne klonovanie (Molecular cloning, Gene cloning) je produkcia veľkého počtu identických molekúl DNA pomocou živých organizmov (baktérií alebo vírusov). Imunocytochemické metódy umožňujú lokalizáciu a identifikáciu bunkových a tkanivových zložiek (antigénov) na základe ich väzby na protilátky. Väzbové miesto sa určí pomocou značených protilátok alebo sekundárneho značenia. Metóda PCR umožňuje určiť prítomnosť patogénu choroby, aj keď je vo vzorke prítomných len niekoľko molekúl DNA patogénu.

Molekulárna biológia sa historicky objavila ako odvetvie biochémie. Za dátum zrodu molekulárnej biológie sa považuje apríl 1953, keď sa v anglickom časopise Nature objavil článok Jamesa Watsona a Francisa Cricka, ktorý navrhoval priestorový model molekuly DNA. Otázka 2. História vývoja molekulárnej biológie. Tento zásadný objav pripravilo dlhé obdobie výskumu genetiky a biochémie vírusov a baktérií. V roku 1928 Frederick Griffith prvýkrát ukázal, že extrakt z teplom usmrtených patogénnych baktérií môže prenášať patogenitu na nie nebezpečné baktérie.

Ďalším dôležitým objavom pre metodiku bol objav bakteriofágových vírusov na začiatku 20. storočia. V 50. rokoch 20. storočia sa ukázalo, že baktérie majú primitívny pohlavný proces, sú schopné vymieňať si extrachromozomálnu DNA - plazmid. Štruktúra bakteriofága Bakteriofágy na povrchu bakteriálnej bunky

Ďalší rozvoj molekulárnej biológie sprevádzal jednak rozvoj jej metodológie, najmä vynájdenie metódy určovania nukleotidovej sekvencie DNA (W. Gilbert a F. Sanger, 1980 - Nobelova cena za chémiu), ako aj nové objavy v oblasti výskumu štruktúry a fungovania génov. Začiatkom 21. storočia boli získané údaje o primárnej štruktúre všetkej DNA u ľudí a mnohých ďalších organizmov, najdôležitejších pre medicínu, poľnohospodárstvo a vedecký výskum, čo viedlo k vzniku niekoľkých nových smerov v biológii. : genomika, bioinformatika atď.).

Odhalenie štruktúry a mechanizmu biologickej funkcie DNA, všetkých typov RNA a ribozómov, odhalenie genetického kódu; objav reverznej transkripcie, t.j. syntézy DNA na templáte RNA; štúdium mechanizmov fungovania respiračných pigmentov; objav trojrozmernej štruktúry a jej funkčnej úlohy v pôsobení enzýmov, objav princípu syntézy matrice a mechanizmov biosyntézy bielkovín; odhalenie štruktúry vírusov a mechanizmov ich replikácie, primárnej a čiastočne aj priestorovej štruktúry protilátok; izolácia jednotlivých génov, chemická a následne biologická (enzymatická) syntéza génu vrátane ľudského mimo bunky (in vitro); prenos génov z jedného organizmu do druhého, vrátane ľudských buniek; detekcia javov „samoorganizácie“ niektorých biologických objektov so zvyšujúcou sa zložitosťou, počnúc molekulami nukleových kyselín až po viaczložkové enzýmy, vírusy, ribozómy atď.; objasnenie alosterických a iných základných princípov regulácie biologických funkcií a procesov. Otázka 3. Najvýznamnejšie úspechy molekulárnej biológie a jej prepojenie s inými vedami. Najvýznamnejšie úspechy molekulárnej biológie:

Záujmy molekulárnych biológov dnes pokrývajú široké spektrum základných vedeckých otázok. Vedúcu úlohu stále zaujíma štúdium štruktúry nukleových kyselín a biosyntézy bielkovín, štúdium štruktúry a funkcií rôznych vnútrobunkových štruktúr a bunkových povrchov.

MOLEKULÁRNA BIOLÓGIA neskorá lat. molekula, zdrobnenina od lat. mólová hmota; biológia) je lekárska a biologická veda, ktorá študuje javy života na úrovni biologických makromolekúl - proteínov a nukleových kyselín, takých jednoduchých systémov, ako sú bezbunkové štruktúry, vírusy a limitne aj na bunkovej úrovni. Väčšina týchto predmetov je neživá alebo obdarená elementárnymi prejavmi života. Pozícia M. b. v systéme biol sú vedy determinované predstavami o štrukturálnych úrovniach živej hmoty, t.j. evolučne vyvinutých foriem života, počnúc prebiotickými krokmi a končiac zložitými systémami: malé organické molekuly - makromolekuly - bunkové a subcelulárne štruktúry - organizmus, atď., respektíve úrovne vedomostí sa budujú aj na Kryme. Historicky M. b. vytvorené ako výsledok štúdia biologických makromolekúl, vďaka ktorým M. b. sa považuje za odvetvie biochémie (pozri). M. b. je zároveň hraničnou vedou, ktorá vznikla na priesečníku biochémie, biofyziky (pozri), organickej chémie (pozri), cytológie (pozri) a genetiky (pozri). Nápad M. b. spočíva v odhaľovaní elementárnych mechanizmov základných procesov života – dedičnosti (pozri), premenlivosti (pozri), pohybu a pod. – prostredníctvom štúdia biol, makromolekúl. Molecular Biol. myšlienky našli živnú pôdu najmä v genetike – vznikla molekulárna genetika (pozri), a práve tu sa dosiahli výsledky, ktoré prispeli k rozvoju M. b. a uznanie jej princípov. Zastúpenia M. b. majú heuristickú (kognitívnu) hodnotu, pretože na všetkých úrovniach vývoja živej hmoty existujú a pôsobia biol, makromolekuly - proteíny (pozri) a nukleové kyseliny (pozri). Z tohto dôvodu hranice M. b. ťažké definovať: ukazuje sa, že ide o všeprenikajúcu vedu.

Samotný názov „molekulárna biológia“ patrí angličtine. kryštalograf W. T. Astbury. Formálny dátum vzniku M. b. Uvažujú o roku 1953, keď J. Watson a F. Crick stanovili štruktúru DNA a urobili predpoklad, ktorý sa neskôr potvrdil, o mechanizme jej replikácie, ktorý je základom dedičnosti. Ale prinajmenšom od roku 1944, počnúc prácou O. Th. Averyho, sa nahromadili dôkazy, ktoré poukazujú na genetickú úlohu DNA; N.K. Koltsov vyjadril myšlienku syntézy matrice vo veľmi jasnej forme už v roku 1928; štúdium molekulárnej podstaty svalovej kontrakcie sa začalo prácami V. A. Engelhardta a M. N. Lyubimovej, publikovanými v rokoch 1939-1942. M. b. rozvinul aj v oblasti evolučných štúdií a systematiky. V ZSSR bol iniciátorom štúdia nukleových kyselín a výskumu molekulárnych základov evolúcie A. N. Belozersky.

Charakteristickým znakom M. b. spočíva v povahe pozorovaní, v ich metodických postupoch a návrhu experimentu. M. b. prinútil biológov pozrieť sa nanovo na materiálny základ života. Pre molekulárnu biol. Výskum charakterizuje porovnávanie biol, funkcií s chémiou. a fyzické charakteristika (vlastnosti) biopolymérov a najmä ich priestorová štruktúra.

Pre pochopenie zákonitostí štruktúry nukleových kyselín a ich správania v bunke je mimoriadne dôležitý princíp komplementarity báz v dvojvláknových štruktúrach nukleových kyselín, ktorý v roku 1953 zaviedli J. Watson a F. Crick. význam priestorových vzťahov je vyjadrený v myšlienke komplementárnosti povrchov makromolekúl a molekulových komplexov, čo predstavuje nevyhnutnú podmienku pre prejav slabých síl, ktoré pôsobia len na krátke vzdialenosti a prispievajú k tvorbe morfolu, diverzite biol. . štruktúr, ich funkčná mobilita. Tieto slabé sily sa podieľajú na tvorbe komplexov ako enzým – substrát, antigén – protilátka, hormón – receptor atď., na javoch samoskladania biologických štruktúr, napríklad ribozómov, na tvorbe párov dusíkatých látok. bázy v molekulách nukleových kyselín a pod.podobné procesy.

M. b. upriamil pozornosť biológov na jednoduché predmety stojace na hraniciach života, zaviedol do arzenálu biologického výskumu myšlienky a presné metódy chémie a fyziky. Mutačný proces bol na molekulárnej úrovni interpretovaný ako strata, inzercia a pohyb segmentov DNA, nahradenie páru dusíkatých báz vo funkčne významných segmentoch genómu (pozri Mutácia). Fenomény mutagenézy (pozri) sa preto preniesli do chémie. Jazyk. Vďaka M. metódam. bol odhalený molekulárny základ takých genetických procesov v prokaryotoch ako rekombinácia (q.v.), transdukcia (q.v.), transformácia (q.v.), transfekcia, sexdukcia. Významný pokrok sa dosiahol v štúdiu štruktúry chromatínu a chromozómov eukaryotov; zdokonalenie metód kultivácie a hybridizácie živočíšnych buniek vytvorilo možnosť rozvoja genetiky somatických buniek (pozri). Reguláciu replikácie DNA vyjadrili v koncepte replikónu F. Jacob a S. Brenner.

V oblasti biosyntézy bielkovín, tzv centrálny postulát charakterizujúci nasledujúci pohyb genetickej informácie: DNA -> messenger RNA -> proteín. Podľa tohto postulátu je proteín akýmsi informačným ventilom, ktorý bráni návratu informácií na úroveň RNA a DNA. V procese vývoja M. b. v roku 1970 objavili H. Temin a D. Baltimore fenomén reverznej transkripcie (v prírode dochádza k syntéze DNA v onkogénnych vírusoch obsahujúcich RNA pomocou špeciálneho enzýmu - reverznej transkriptázy). Syntézy proteínov a nukleových kyselín prebiehajú podľa typu syntéz matrice, na ich výskyt je potrebná matrica (šablóna) - pôvodná molekula polyméru, ktorá predurčuje poradie nukleotidov (aminokyselín) v syntetizovanej kópii. Takýmito templátmi na replikáciu a transkripciu sú DNA a na transláciu - messenger RNA. Genetický kód (pozri) formuluje spôsob, ako „zaznamenať“ dedičnú informáciu v messenger RNA, inými slovami, koordinuje sekvenciu nukleotidov v nukleových kyselinách a aminokyselín v proteínoch. Transkripcia je spojená s biosyntézou proteínov - syntéza messengerových RNA na matrici DNA, katalyzovaná RNA polymerázami; translácia je syntéza proteínu na messenger RNA spojená s ribozómom, ktorá prebieha podľa veľmi zložitého mechanizmu, na ktorom sa podieľajú desiatky pomocných proteínov a transferových RNA (pozri Ribozómy). Regulácia syntézy proteínov je najviac študovaná na transkripčnej úrovni a je formulovaná v myšlienkach F. Jacoba a J. Monoda o operóne, represorových proteínoch, alosterickom efekte, pozitívnej a negatívnej regulácii. Obsahom heterogénny a ešte menej úplný ako predchádzajúce, oddiel M. b. je množstvo problémov základného a aplikovaného charakteru. Patrí medzi ne oprava poškodenia genómu spôsobeného krátkovlnným žiarením, mutagénmi (pozri) a inými vplyvmi. Veľkú nezávislú oblasť tvoria štúdie mechanizmu účinku enzýmov, založené na predstavách o trojrozmernej štruktúre bielkovín a úlohe slabých chemikálií. interakcie. M. b. objasnil mnohé podrobnosti o štruktúre a vývoji vírusov, najmä bakteriofágov. Štúdium hemoglobínov u osôb trpiacich kosáčikovitou anémiou (pozri) a inými hemoglobinopatiami (pozri) znamenalo začiatok štúdia štrukturálneho základu „molekulárnych chorôb“, vrodených „chyb“ metabolizmu (pozri Dedičné choroby). Najnovším odvetvím M. b. je genetické inžinierstvo (pozri. ) - vyvíja metódy konštrukcie dedičných štruktúr vo forme rekombinantných molekúl DNA.

V molekulárnom biol. V experimentoch sa používajú rôzne metódy chromatografie (pozri) a ultracentrifugácie (pozri), rôntgenovej difrakčnej analýzy (pozri), elektrónovej mikroskopie (pozri), molekulovej spektroskopie (elektrónová paramagnetická a nukleárna magnetická rezonancia). Začalo sa využívať synchrotrónové (magnetické brzdné žiarenie), neutrónová difrakcia, Mössbauerova spektroskopia a laserová technológia. Modelové systémy a získavanie mutácií sú široko používané v experimentoch. Použitie rádioaktívnych a (v menšej miere) ťažkých izotopov je v M. b. obvyklé analytické metódy, ako aj použitie matematických metód a počítačov. Ak sa skorší molekulárni biológovia riadili Ch. arr. na fyzickom metódy vytvorené na štúdium nebiolových polymérov. pôvodu, v súčasnosti existuje rastúci trend smerom k používaniu chemikálií. metódy.

Pre rozvoj M. b. v ZSSR uznesenie Ústredného výboru KSSZ a Rady ministrov ZSSR „O opatreniach na urýchlenie rozvoja molekulárnej biológie a molekulárnej genetiky a využitie ich úspechov v národnom hospodárstve“, zverejnené 20. , 1974, mal veľký význam Výskum koordinuje Medzirezortná vedecko-technická rada pre problémy molekulárnej biológie a molekulárnej genetiky pri Štátnom výbore pre vedu a techniku ​​Rady ministrov ZSSR a Akadémie vied ZSSR. Vedecká rada pre problémy molekulárnej biológie Akadémie vied ZSSR, podobné rady Akadémie vied zväzových republík a odvetvové akadémie. Vychádza časopis "Molecular Biology" (od roku 1967) a abstraktný časopis s rovnakým názvom. Výskum M. b. sa uskutočňujú v ústavoch Akadémie vied ZSSR, Akadémie lekárskych vied ZSSR, Republikových akadémií vied, Hlavného mikrobiologického priemyslu a na vysokých školách v krajine. V socialistických krajinách pôsobí mnoho laboratórií tohto profilu. V Európe existuje Európska organizácia pre molekulárnu biológiu (EMBO), Európske laboratórium molekulárnej biológie (EMBL) v Heidelbergu a Európska konferencia molekulárnej biológie (EMBC). Veľké špecializované laboratóriá sú v USA, Francúzsku, Veľkej Británii, Nemecku a ďalších krajinách.

Odborné periodiká venované problematike M. b. v zahraničí: „Journal of Molecular Biology“, „Nucleic Acids Research“, „Molecular Biology Reports“, „Gene“.

Recenzie na M. b. publikované v sérii „Molecular Biology“ od VINITI, v „Progress in Nucleic Acids Research and Molecular Biology“, „Progress in Biophysics and Molecular Biology“, „Annual Review of Biochemistry“, publikáciách „Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology“ “.

Bibliografia: Ashmarin I.P. Molecular biology, Leningrad, 1977; Belozersky A. N. Molekulárna biológia - nová etapa poznania prírody, M., 1970; Bresler S. E. Molecular biology, L., 1973; Koltsov N.K. Dedičné molekuly, Bull. Moskva o-va test. prírody, odd. biol., t. 70, v. 4, str. 75, 1965; October and Science, ed. A.P. Alexandrova a kol., s. 393, 417, M., 1977; Severin S. E. Moderné problémy fyzikálnej a chemickej biológie, v knihe: 250 rokov Akadémie vied ZSSR, s. 332, M., 1977; Watson J. Molekulárna biológia: gén, trans. z angličtiny, M., 1978; Engelhardt V. A. Molecular biology, v knihe: Development of Biol, in the ZSSR, ed. B. E. Bykhovský, s. 598, M., 1967.

Rozvoj biochémie, biofyziky, genetiky, cytochémie, mnohých odborov mikrobiológie a virológie okolo začiatku 40. rokov 20. storočia. úzko viedli k štúdiu životných javov na molekulárnej úrovni. Úspechy dosiahnuté týmito vedami súčasne a z rôznych strán viedli k poznaniu skutočnosti, že na molekulárnej úrovni fungujú hlavné riadiace systémy tela a že ďalší pokrok týchto vied bude závisieť od odhalenia biologické funkcie molekúl tvoriacich telá organizmov, ich účasť na syntéze a dezintegrácii, vzájomných premenách a reprodukcii zlúčenín v bunke, ako aj z toho vyplývajúca výmena energie a informácií. Na priesečníku týchto biologických disciplín s chémiou a fyzikou tak vznikol úplne nový odbor – molekulárna biológia.

Na rozdiel od biochémie sa pozornosť modernej molekulárnej biológie sústreďuje predovšetkým na štúdium štruktúry a funkcie najdôležitejších tried biopolymérov - proteínov a nukleových kyselín, z ktorých prvé určujú samotnú možnosť metabolických reakcií a druhé - tzv. biosyntéza špecifických proteínov. Je teda jasné, že nie je možné jasne rozlišovať medzi molekulárnou biológiou a biochémiou, zodpovedajúcimi sekciami genetiky, mikrobiológie a virológie.

Vznik molekulárnej biológie úzko súvisel s vývojom nových výskumných metód, o ktorých už bola reč v príslušných kapitolách. Spolu s rozvojom elektrónovej mikroskopie a ďalších metód mikroskopickej techniky zohrali veľkú úlohu metódy frakcionácie bunkových elementov vyvinuté v 50. rokoch. Boli založené na zdokonalených metódach diferenciálnej centrifugácie (A. Claude, 1954). V tom čase už existovali pomerne spoľahlivé metódy na izoláciu a frakcionáciu biopolymérov. Patrí sem najmä metóda frakcionácie proteínov pomocou elektroforézy, ktorú navrhol A. Tiselius (1937; Nobelova cena, 1948), metódy izolácie a purifikácie nukleových kyselín (E. Kay, A. Downs, M. Sevag, A. Mirsky atď.). Súčasne boli v mnohých laboratóriách po celom svete vyvinuté rôzne metódy chromatografickej analýzy (A. Martin a R. Singh, 1941; Nobelova cena, 1952), následne výrazne zdokonalené.

Röntgenová difrakčná analýza zohrala neoceniteľnú službu pri dešifrovaní štruktúry biopolymérov. Základné princípy röntgenovej difrakčnej analýzy boli vyvinuté na King's College, University of London, pod vedením W. Bragga, skupinou výskumníkov, ku ktorým patrili J. Bernal, A. Lonsdale, W. Astbury, J. Robertson a iní.

Za zmienku stojí najmä výskum profesora Moskovskej štátnej univerzity A. R. Kizela o biochémii protoplazmy (1925 - 1929), ktorý bol mimoriadne dôležitý pre ďalší rozvoj molekulárnej biológie. Kiesel zasadil ranu pevne zakorenenej myšlienke, že základom každej protoplazmy je špeciálne proteínové telo - platničky, ktoré údajne určujú všetky jej najdôležitejšie štrukturálne a funkčné vlastnosti. Ukázal, že plastín je proteín, ktorý sa nachádza iba v myxomycétach a potom v určitom štádiu vývoja a že v protoplazme neexistuje žiadna trvalá zložka - jediný kostrový proteín. Štúdium problému štruktúry protoplazmy a funkčnej úlohy proteínov tak nabralo správnu cestu a získalo priestor pre svoj rozvoj. Kieselov výskum získal celosvetové uznanie a stimuloval štúdium chémie základných častí bunky.

Pojem „molekulárna biológia“, ktorý prvýkrát použil anglický kryštalograf profesor Leedsskej univerzity W. Astbury, sa pravdepodobne objavil začiatkom 40. rokov (pred rokom 1945). Astburyho kľúčové röntgenové difrakčné štúdie proteínov a DNA v 30. rokoch poskytli základ pre jeho následné úspešné rozlúštenie sekundárnej štruktúry týchto biopolymérov. V roku 1963 J. Bernal napísal: „Pomník mu postaví celá molekulárna biológia – veda, ktorú pomenoval a skutočne založil“ * V literatúre sa tento termín prvýkrát objavil snáď v roku 1946 v r. článok W. Astburyho „Progress of X-ray difraction analysis of organic and fibrillar materials“, publikovaný v anglickom časopise Nature**. Astbury (1950) vo svojej prednáške Harvey (1950) poznamenal: "Som rád, že termín molekulárna biológia je teraz pomerne široko používaný, aj keď je nepravdepodobné, že by som ho navrhol ja ako prvý. Páčil sa mi a dlho som sa ho pokúšal šíriť. “***. Už v roku 1950 mal Astbury jasno v tom, že molekulárna biológia sa zaoberá predovšetkým štruktúrou a konformáciou makromolekúl, ktorých štúdium je kľúčové pre pochopenie fungovania živých organizmov.

* (Biogr. Mem. Kolegovia Roy. Soc, 1963, v. 9, 29.)

** (W. T. Astbury. Pokrok v röntgenovej analýze organických a vláknitých štruktúr.- Príroda,. 1946, v. 157, 121.)

*** (W. T. Astbury. Dobrodružstvá v molekulárnej biológii. Thomas Springfield, 1952, s. 3.)

Molekulárna biológia čelila a čelí v podstate tým istým úlohám ako celá biológia ako celok – poznanie podstaty života a jeho základných javov, najmä dedičnosti a premenlivosti. Moderná molekulárna biológia je primárne určená na dešifrovanie štruktúry a funkcie génov, ciest a mechanizmov implementácie genetickej informácie organizmov v rôznych štádiách ontogenézy a v rôznych štádiách jej čítania. Je navrhnutý tak, aby odhalil jemné mechanizmy regulácie génovej aktivity a diferenciácie buniek, objasnil podstatu mutagenézy a molekulárny základ evolučného procesu.

Stanovenie genetickej úlohy nukleových kyselín

Pre rozvoj molekulárnej biológie mali najväčší význam nasledujúce objavy. V roku 1944 americkí výskumníci O. Avery, K. McLeod (Nobelova cena, 1923) a M. McCarthy ukázali, že molekuly DNA izolované z pneumokokov majú transformačnú aktivitu. Po hydrolýze týchto DNA deoxyribonukleázou ich transformačná aktivita úplne vymizla. Prvýkrát sa tak presvedčivo dokázalo, že genetické funkcie v bunke má DNA, a nie proteín.

Aby sme boli spravodliví, treba poznamenať, že fenomén bakteriálnej transformácie bol objavený oveľa skôr ako objav Averyho, McLeoda a McCarthyho. V roku 1928 F. Griffith publikoval článok, v ktorom uvádza, že po pridaní usmrtených buniek zapuzdreného virulentného kmeňa k nevirulentným (nezapuzdreným) pneumokokom sa výsledná zmes buniek stáva pre myši deštruktívnou. Navyše živé pneumokokové bunky izolované zo zvierat infikovaných touto zmesou už boli virulentné a mali polysacharidové puzdro. V tomto experimente sa teda ukázalo, že vplyvom niektorých zložiek usmrtených pneumokokových buniek sa nekapsulovaná forma baktérií mení na virulentnú formu tvoriacu kapsuly. O 16 rokov neskôr Avery, McLeod a McCarthy v tomto experimente nahradili usmrtené celé pneumokokové bunky ich deoxyribonukleovou kyselinou a ukázali, že to bola DNA, ktorá mala transformačnú aktivitu (pozri tiež kapitoly 7 a 25). Význam tohto objavu je ťažké preceňovať. Podnietilo to štúdium nukleových kyselín v mnohých laboratóriách po celom svete a prinútilo vedcov zamerať svoju pozornosť na DNA.

Spolu s objavom Averyho, McLeoda a McCarthyho sa začiatkom 50. rokov nazhromaždilo pomerne veľké množstvo priamych a nepriamych dôkazov o tom, že nukleové kyseliny hrajú v živote výnimočnú úlohu a majú genetickú funkciu. Naznačoval to najmä charakter lokalizácie DNA v bunke a údaje R. Vendrelyho (1948), že obsah DNA na bunku je striktne konštantný a koreluje so stupňom ploidie: v haploidných zárodočných bunkách existuje je o polovicu menej DNA ako v diploidných somatických bunkách. Genetická úloha DNA bola podporená aj jej výraznou metabolickou stabilitou. Začiatkom 50-tych rokov sa nahromadilo mnoho rôznych faktov, ktoré naznačujú, že väčšina známych mutagénnych faktorov pôsobí primárne na nukleové kyseliny a najmä na DNA (R. Hotchkiss, 1949; G. Ephrussi-Taylor, 1951; E. Freese, 1957 atď.).

Osobitný význam pri stanovení genetickej úlohy nukleových kyselín malo štúdium rôznych fágov a vírusov. V roku 1933 našiel D. Schlesinger DNA v bakteriofágu Escherichia coli. Od izolácie vírusu tabakovej mozaiky (TMV) v kryštalickom stave W. Stanleym (1935, Nobelova cena, 1946) sa začala nová etapa štúdia rastlinných vírusov. V rokoch 1937-1938 F. Bowden a N. Pirie, zamestnanci poľnohospodárskej stanice Rothamsted (Anglicko), ukázali, že mnohé rastlinné vírusy, ktoré izolovali, nie sú globulíny, ale sú to ribonukleoproteíny a ako povinnú zložku obsahujú nukleovú kyselinu. Na samom začiatku 40. rokov boli publikované práce G. Schramma (1940), P. A. Agatova (1941), G. Millera a W. Stanleyho (1941), ktoré naznačujú, že výrazná chemická modifikácia proteínovej zložky nevedie k strata infekčnosti TMV. To naznačovalo, že proteínová zložka nemôže byť nositeľom dedičných vlastností vírusu, ako sa mnohí mikrobiológovia naďalej domnievali. Presvedčivé dôkazy v prospech genetickej úlohy nukleovej kyseliny (RNA) v rastlinných vírusoch získali v roku 1956 G. Schramm v Tübingene (Nemecko) a H. Frenkel-Konrath v Kalifornii (USA). Títo výskumníci takmer súčasne a nezávisle od seba izolovali RNA z TMV a ukázali, že je to práve ona, a nie proteín, ktorý je infekčný: v dôsledku infekcie tabakových rastlín touto RNA sa vytvorili a rozmnožili normálne vírusové častice. ich. To znamenalo, že RNA obsahovala informácie pre syntézu a zostavenie všetkých vírusových zložiek, vrátane vírusového proteínu. V roku 1968 I.G. Atabekov zistil, že proteín hrá významnú úlohu pri samotnej infekcii rastlín - povaha proteínu určuje rozsah hostiteľských rastlín.

V roku 1957 Frenkel-Konrath ako prvý zrekonštruoval TMV z jeho základných zložiek – RNA a proteínu. Spolu s normálnymi časticami získal zmiešané „hybridy“, v ktorých bola RNA z jedného kmeňa a proteín z druhého. Dedičnosť takýchto hybridov bola úplne určená RNA a potomstvo vírusov patrilo ku kmeňu, ktorého RNA bola použitá na získanie pôvodných zmiešaných častíc. Neskoršie experimenty A. Gierera, G. Schustera a G. Schramma (1958) a G. Vitmana (1960 - 1966) ukázali, že chemická modifikácia nukleárnej zložky TMV vedie k objaveniu sa rôznych mutantov tohto vírusu.

V roku 1970 D. Baltimore a G. Temin zistili, že prenos genetickej informácie môže nastať nielen z DNA do RNA, ale aj naopak. V niektorých onkogénnych RNA vírusoch (onkornavírusoch) objavili špeciálny enzým, takzvanú reverznú transkriptázu, ktorá je schopná komplementárne syntetizovať DNA na reťazcoch RNA. Tento významný objav umožnil pochopiť mechanizmus vkladania genetickej informácie vírusov obsahujúcich RNA do hostiteľského genómu a nový pohľad na povahu ich onkogénneho pôsobenia.

Objav nukleových kyselín a štúdium ich vlastností

Termín nukleové kyseliny zaviedol nemecký biochemik R. Altmann v roku 1889 po tom, čo tieto zlúčeniny v roku 1869 objavil švajčiarsky lekár F. Miescher. Miescher extrahoval bunky hnisu zriedenou kyselinou chlorovodíkovou počas niekoľkých týždňov a zanechal po sebe takmer čistý jadrový materiál. Tento materiál považoval za charakteristickú "látku bunkových jadier a nazval ho nukleín. Svojimi vlastnosťami sa nukleín výrazne líšil od bielkovín: bol kyslejší, neobsahoval síru, ale mal veľa fosforu, dobre sa rozpúšťal v zásadách, nukleín sa veľmi dobre rozpúšťal v alkáliách." ale nerozpúšťal sa v zriedených kyselinách.

Miescher poslal výsledky svojich pozorovaní nukleínu F. Hoppe-Seylerovi na publikovanie v časopise. Látka, ktorú opísal, bola taká nezvyčajná (v tom čase bol medzi všetkými biologickými zlúčeninami obsahujúcimi fosfor známy iba lecitín), že Hoppe-Seyler neveril Miescherovým experimentom, vrátil mu rukopis a poučil svojich zamestnancov N. Ploscha a N. Lyubavina aby skontroloval svoje závery na inom materiáli . Miescherova práca „O chemickom zložení hnisových buniek“ bola publikovaná o dva roky neskôr (1871). Zároveň boli publikované práce Hoppe-Seylera a jeho kolegov o zložení buniek hnisu, erytrocytov vtákov, hadov a iných buniek. Počas nasledujúcich troch rokov bol nukleín izolovaný zo živočíšnych buniek a kvasiniek.

Miescher vo svojej práci poznamenal, že podrobná štúdia rôznych nukleínov by mohla viesť k zisteniu rozdielov medzi nimi, a tým predvídať myšlienku špecifickosti nukleových kyselín. Štúdiom lososového mlieka Miescher zistil, že nukleín je v ňom prítomný vo forme soli a je spojený s hlavným proteínom, ktorý nazval protamín.

V roku 1879 začal A. Kossel študovať nukleíny v Hoppe-Seylerovom laboratóriu. V roku 1881 izoloval hypoxantín z nukleínu, no vtedy ešte pochyboval o pôvode tejto bázy a veril, že hypoxantín môže byť produktom degradácie bielkovín. V roku 1891 objavil Kossel medzi produktmi hydrolýzy nukleínu adenín, guanín, kyselinu fosforečnú a ďalšiu látku s vlastnosťami cukru. Za výskum chémie nukleových kyselín získal Kossel v roku 1910 Nobelovu cenu.

Ďalšie pokroky v dešifrovaní štruktúry nukleových kyselín sú spojené s výskumom P. Levina a spolupracovníkov (1911 - 1934). V roku 1911 P. Levin a V. Jacobs identifikovali sacharidovú zložku adenozínu a guanozínu; zistili, že tieto nukleozidy obsahujú D-ribózu. V roku 1930 Lewin ukázal, že sacharidová zložka deoxyribonukleozidov je 2-deoxy-D-ribóza. Z jeho práce sa stalo známe, že nukleové kyseliny sú postavené z nukleotidov, t.j. fosforylovaných nukleozidov. Lewin veril, že hlavným typom väzby v nukleových kyselinách (RNA) je 2", 5" fosfodiesterová väzba. Táto myšlienka sa ukázala ako nesprávna. Vďaka práci anglického chemika A. Todda (Nobelova cena, 1957) a jeho kolegov, ako aj anglických biochemikov R. Markhama a J. Smitha sa začiatkom 50. rokov stalo známe, že hlavným typom väzby v RNA je 3", 5"- fosfodiesterová väzba.

Levin ukázal, že rôzne nukleové kyseliny sa môžu líšiť v povahe sacharidovej zložky: niektoré z nich obsahujú cukor deoxyribózu, zatiaľ čo iné obsahujú ribózu. Okrem toho sa tieto dva typy nukleových kyselín líšili povahou jednej zo zásad: nukleové kyseliny pentózového typu obsahovali uracil a nukleové kyseliny deoxypentózového typu obsahovali tymín. Nukleová kyselina deoxypentózová (v modernej terminológii kyselina deoxyribonukleová - DNA) sa zvyčajne ľahko izolovala vo veľkých množstvách z týmusu teliat. Preto dostala názov kyselina tymonukleová. Zdrojom pentózovej nukleovej kyseliny (RNA) boli najmä kvasinky a pšeničné klíčky. Tento typ sa často nazýval kvasinková nukleová kyselina.

Začiatkom 30. rokov 20. storočia bola celkom pevne zakorenená myšlienka, že rastlinné bunky sú charakterizované nukleovou kyselinou kvasinkového typu a tymonukleová kyselina je charakteristická len pre jadrá živočíšnych buniek. Dva typy nukleových kyselín - RNA a DNA - sa v tom čase nazývali rastlinné a živočíšne nukleové kyseliny. Ako však ukázali rané štúdie A. N. Belozerského, takéto delenie nukleových kyselín je neopodstatnené. V roku 1934 Belozersky prvýkrát objavil tymonukleovú kyselinu v rastlinných bunkách: zo sadeníc hrachu izoloval a identifikoval tymín-pyrimidínovú bázu, charakteristickú pre DNA. Potom objavil tymín v iných rastlinách (sójové semená, fazuľa). V roku 1936 A. N. Belozersky a I. I. Dubrovskaya izolovali preparatívnu DNA zo sadeníc pagaštanu konského. Okrem toho séria prác vykonaných v 40. rokoch v Anglicku D. Davidsonom a jeho kolegami presvedčivo ukázala, že rastlinná nukleová kyselina (RNA) je obsiahnutá v mnohých živočíšnych bunkách.

Široké využitie cytochemickej reakcie pre DNA vyvinutú R. Felgenom a G. Rosenbeckom (1924) a reakcie J. Bracheta (1944) pre RNA umožnili pomerne rýchlo a jednoznačne vyriešiť otázku preferenčnej lokalizácie týchto nukleových kyselín v bunke. Ukázalo sa, že DNA je koncentrovaná v jadre, zatiaľ čo RNA je prevažne koncentrovaná v cytoplazme. Neskôr sa zistilo, že RNA je obsiahnutá v cytoplazme aj v jadre a navyše bola identifikovaná cytoplazmatická DNA.

Pokiaľ ide o otázku primárnej štruktúry nukleových kyselín, v polovici 40. rokov sa vo vede pevne etablovala myšlienka P. Levina, podľa ktorej sú všetky nukleové kyseliny zostavené podľa rovnakého typu a pozostávajú z identických takzvaných tetranukleotidových blokov. Každý z týchto blokov podľa Levina obsahuje štyri rôzne nukleotidy. Tetranukleotidová teória štruktúry nukleových kyselín do značnej miery pripravila tieto biopolyméry o špecifickosť. Preto nie je prekvapujúce, že v tom čase bola všetka špecifickosť živých vecí spojená iba s proteínmi, ktorých povaha monomérov je oveľa rozmanitejšia (20 aminokyselín).

Prvú dieru v teórii tetranukleotidovej štruktúry nukleových kyselín urobili analytické údaje anglického chemika J. Gulanda (1945 - 1947). Pri určovaní zloženia nukleových kyselín na základe dusíka zásad nezískal ekvimolárny pomer zásad, ako by to malo byť podľa Lewinovej teórie. Tetranukleotidová teória štruktúry nukleových kyselín napokon zanikla ako výsledok výskumu E. Chargaffa a jeho kolegov (1949 - 1951). Na oddelenie báz uvoľnených z DNA v dôsledku jej kyslej hydrolýzy použil Chargaff papierovú chromatografiu. Každá z týchto báz bola presne stanovená spektrofotometricky. Chargaff si všimol významné odchýlky od ekvimolárneho pomeru báz v DNA rôzneho pôvodu a po prvýkrát definitívne uviedol, že DNA má výraznú druhovú špecifickosť. Tým sa skončila hegemónia konceptu proteínovej špecifickosti v živej bunke. Analýzou DNA rôzneho pôvodu Chargaff objavil a sformuloval jedinečné vzorce zloženia DNA, ktoré vstúpili do vedy pod názvom Chargaffove pravidlá. Podľa týchto pravidiel sa vo všetkých DNA bez ohľadu na pôvod množstvo adenínu rovná množstvu tymínu (A = T), množstvo guanínu sa rovná množstvu cytozínu (G = C), počet purínov sa rovná počtu pyrimidínov (G + A = C + T), množstvo báz so 6-aminoskupinami sa rovná počtu báz so 6-ketoskupinami (A+C=G+T). Zároveň, napriek takýmto prísnym kvantitatívnym zhodám, sa DNA rôznych druhov líši v hodnote pomeru A+T:G+C. V niektorých DNA prevažuje množstvo guanínu a cytozínu nad množstvom adenínu a tymínu (Chargaff nazval tieto DNA DNA typu GC); iné DNA obsahovali viac adenínu a tymínu ako guanín a cytozín (tieto DNA sa nazývali DNA typu AT). Údaje o zložení DNA, ktoré získal Chargaff, zohrali v molekulárnej biológii výnimočnú úlohu. Tvorili základ pre objav štruktúry DNA uskutočnený v roku 1953 J. Watsonom a F. Crickom.

V roku 1938 W. Astbury a F. Bell pomocou röntgenovej difrakčnej analýzy ukázali, že roviny báz v DNA by mali byť kolmé na dlhú os molekuly a pripomínať hromadu dosiek ležiacich na sebe. . Ako sa technológia röntgenovej štrukturálnej analýzy zlepšila, v rokoch 1952 - 1953. nahromadili sa informácie, ktoré umožňujú posúdiť dĺžku jednotlivých väzieb a uhly sklonu. To umožnilo s najväčšou pravdepodobnosťou znázorniť povahu orientácie kruhov pentózových zvyškov v sacharidovo-fosfátovom hlavnom reťazci molekuly DNA. V roku 1952 S. Farberg navrhol dva špekulatívne modely DNA, ktoré predstavovali jednovláknovú molekulu zloženú alebo skrútenú na sebe. Rovnako špekulatívny model štruktúry DNA navrhli v roku 1953 L. Pauling (nositeľ Nobelovej ceny, 1954) a R. Corey. V tomto modeli tri skrútené vlákna DNA vytvorili dlhú špirálu, ktorej jadro predstavovali fosfátové skupiny a bázy sa nachádzali mimo nej. V roku 1953 M. Wilkins a R. Franklin získali jasnejšie röntgenové obrazce DNA. Ich analýza ukázala úplné zlyhanie modelov Farberga, Paulinga a Coreyho. Pomocou Chargaffových údajov, porovnávaním rôznych kombinácií molekulárnych modelov jednotlivých monomérov a údajov röntgenovej difrakcie, J. Watson a F. Crick v roku 1953 dospeli k záveru, že molekula DNA musí byť dvojvláknová špirála. Chargaffove pravidlá ostro obmedzili počet možných usporiadaných kombinácií báz v navrhovanom modeli DNA; navrhli Watsonovi a Crickovi, že molekula DNA musí mať špecifické párovanie báz – adenín s tymínom a guanín s cytozínom. Inými slovami, adenín v jednom reťazci DNA vždy presne zodpovedá tymínu v inom reťazci a guanín v jednom reťazci nevyhnutne zodpovedá cytozínu v inom reťazci. Watson a Crick teda ako prví sformulovali mimoriadne dôležitý princíp komplementárnej štruktúry DNA, podľa ktorého jeden reťazec DNA dopĺňa druhý, t. j. sekvencia báz jedného reťazca jednoznačne určuje sekvenciu báz v druhom reťazci ( komplementárny) reťazec. Ukázalo sa, že samotná štruktúra DNA už obsahuje potenciál na jej presnú reprodukciu. Tento model štruktúry DNA je v súčasnosti všeobecne akceptovaný. Za rozlúštenie štruktúry DNA dostali Crick, Watson a Wilkins v roku 1962 Nobelovu cenu.

Treba poznamenať, že myšlienka mechanizmu na presnú reprodukciu makromolekúl a prenos dedičných informácií vznikla v našej krajine. V roku 1927 N. K. Koltsov navrhol, že počas reprodukcie buniek dochádza k reprodukcii molekúl prostredníctvom presnej autokatalytickej reprodukcie existujúcich materských molekúl. Je pravda, že v tom čase Koltsov obdaril túto vlastnosť nie molekulami DNA, ale molekulami proteínovej povahy, ktorých funkčný význam bol vtedy neznámy. Samotná myšlienka autokatalytickej reprodukcie makromolekúl a mechanizmus prenosu dedičných vlastností sa však ukázal ako prorocký: stal sa hlavnou myšlienkou modernej molekulárnej biológie.

Dlhodobé štúdie (1957-1974) zloženia DNA väčšiny rôznych organizmov plne potvrdili vzory objavené Chargaffom a úplnú zhodu s molekulárnym modelom štruktúry DNA navrhnutým Watsonom a Crickom. Tieto štúdie ukázali, že DNA rôznych baktérií, húb, rias, aktinomycét, vyšších rastlín, bezstavovcov a stavovcov má špecifické zloženie. Rozdiely v zložení (obsah párov báz AT) sú obzvlášť výrazné u mikroorganizmov, čo sa ukázalo byť dôležitým taxonomickým znakom. U vyšších rastlín a živočíchov sú druhovo špecifické variácie v zložení DNA oveľa menej výrazné. To však neznamená, že ich DNA je menej špecifická. Okrem zloženia báz je špecifickosť do značnej miery určená ich sekvenciou v reťazcoch DNA.

Spolu s obyčajnými bázami boli v DNA a RNA objavené ďalšie dusíkaté bázy. G. White (1950) teda našiel 5-metylcytozín v DNA rastlín a živočíchov a D. Dunn a J. Smith (1958) objavili v niektorých DNA metylovaný adenín. Metylcytozín bol dlho považovaný za charakteristický znak genetického materiálu vyšších organizmov. V roku 1968 A. N. Belozersky, B. F. Vanyushin a N. A. Kokurina zistili, že ho možno nájsť aj v DNA baktérií.

V roku 1964 M. Gold a J. Hurwitz objavili novú triedu enzýmov, ktoré vykonávajú prirodzenú modifikáciu DNA - jej metyláciu. Po tomto objave sa ukázalo, že minoritné (obsiahnuté v malom množstve) bázy sa objavujú na hotovom polynukleotidovom reťazci DNA ako výsledok špecifickej metylácie cytozínových a adenínových zvyškov v špeciálnych sekvenciách. Najmä podľa B. F. Vanyushina, Ya. I. Buryanova a A. N. Belozerského (1969) sa metylácia adenínu v DNA Escherichia coli môže vyskytovať v stop kodónoch. Podľa A. N. Belozerského a spolupracovníkov (1968 - 1970), ako aj M. Meselsona (USA) a V. Arbera (Švajčiarsko) (1965 - 1969) dáva metylácia molekulám DNA jedinečné individuálne vlastnosti a v kombinácii s pôsobením špecifických nukleáz, je súčasťou komplexného mechanizmu, ktorý riadi syntézu DNA v bunke. Inými slovami, povaha metylácie konkrétnej DNA určuje, či sa môže reprodukovať v danej bunke.

Takmer v rovnakom čase začala izolácia a intenzívne štúdium DNA metyláz a reštrikčných endonukleáz; v rokoch 1969-1975 boli stanovené nukleotidové sekvencie rozpoznávané v DNA niektorými z týchto enzýmov (X. Boyer, X. Smith, S. Lynn, K. Murray). Keď sú rôzne DNA hydrolyzované reštrikčným enzýmom, uvoľňujú sa pomerne veľké fragmenty s identickými „lepivými“ koncami. To umožňuje nielen analyzovať štruktúru génov, ako to bolo v prípade malých vírusov (D. Nathans, S. Adler, 1973 - 1975), ale aj konštruovať rôzne genómy. S objavom týchto špecifických reštrikčných enzýmov sa genetické inžinierstvo stalo hmatateľnou realitou. Gény rôzneho pôvodu vložené do malej plazmidovej DNA sa už ľahko zavádzajú do rôznych buniek. Tak sa získal nový typ biologicky aktívnych plazmidov, ktoré poskytli rezistenciu voči určitým antibiotikám (S. Cohen, 1973), ribozomálne gény žaby a Drosophila boli zavedené do plazmidov Escherichia coli (J. Morrow, 1974; H. Boyer, D. Hogness, R. Davis, 1974 - 1975). Tak sa otvorili skutočné cesty na získanie zásadne nových organizmov zavedením a integráciou rôznych génov do ich genofondu. Tento objav môže byť použitý v prospech celého ľudstva.

V roku 1952 G. White a S. Cohen zistili, že DNA fágov T-párnych obsahuje nezvyčajnú bázu – 5-hydroxymetylcytozín. Neskôr z prác E. Volkina a R. Sinsheimera (1954) a Cohena (1956) sa zistilo, že hydroxymetylcytozínové zvyšky môžu byť úplne alebo čiastočne glukozidované, v dôsledku čoho je molekula fágovej DNA chránená pred hydrolytickým účinkom. nukleáz.

Začiatkom 50-tych rokov z prác D. Dunna a J. Smitha (Anglicko), S. Zamenhofa (USA) a A. Wackera (Nemecko) sa zistilo, že v DNA môžu byť zahrnuté mnohé umelé analógy báz, niekedy nahradenie až 50 % Timiny. Tieto substitúcie spravidla vedú k chybám v replikácii, transkripcii a translácii DNA a k výskytu mutantov. J. Marmur (1962) teda zistil, že DNA niektorých fágov obsahuje hydroxymetyluracil namiesto tymínu. V roku 1963 I. Takahashi a J. Marmur zistili, že DNA jedného z fágov obsahuje uracil namiesto tymínu. Tak sa zrútil ďalší princíp, ktorým sa predtým separovali nukleové kyseliny. Od práce P. Levina sa verilo, že charakteristickým znakom DNA je tymín a RNA je uracil. Ukázalo sa, že tento znak nie je vždy spoľahlivý a zásadný rozdiel v chemickej povahe týchto dvoch typov nukleových kyselín, ako sa dnes ukazuje, je iba povaha sacharidovej zložky.

Počas štúdia fágov sa odhalilo veľa nezvyčajných znakov organizácie nukleových kyselín. Od roku 1953 sa verilo, že všetka DNA sú dvojvláknové lineárne molekuly a RNA je iba jednovláknová. Táto pozícia bola výrazne otrasená v roku 1961, keď R. Sinsheimer zistil, že DNA fága φ X 174 je reprezentovaná jednovláknovou kruhovou molekulou. Pravda, neskôr sa ukázalo, že v tejto forme táto DNA existuje len vo vegetatívnej fágovej častici a replikatívna forma DNA tohto fága je tiež dvojvláknová. Navyše sa celkom neočakávane ukázalo, že RNA niektorých vírusov môže byť dvojvláknová. Tento nový typ makromolekulovej organizácie RNA objavili v roku 1962 P. Gomatos, I. Tamm a ďalší výskumníci v niektorých živočíšnych vírusoch a vo víruse nádorových rán rastlín. Nedávno V. I. Agol a A. A. Bogdanov (1970) zistili, že okrem lineárnych molekúl RNA existujú aj uzavreté alebo cyklické molekuly. Identifikovali cyklickú dvojvláknovú RNA, najmä vo víruse encefalomyelokarditídy. Vďaka práci X. Deveaua, L. Tinoka, T. I. Tikhonenka, E. I. Budovského a iných (1960 - 1974) sa stali známymi hlavné črty organizácie (ukladanie) genetického materiálu v bakteriofágoch.

Koncom 50-tych rokov americký vedec P. Doty zistil, že pri zahrievaní dochádza k denaturácii DNA, sprevádzanej prerušovaním vodíkových väzieb medzi pármi báz a divergenciou komplementárnych reťazcov. Tento proces má charakter fázového prechodu „špirálovo-cievkový“ a pripomína topenie kryštálov. Doty preto nazval proces tepelnej denaturácie DNA tavením DNA. Pri pomalom ochladzovaní dochádza k renaturácii molekúl, teda k opätovnému zjednoteniu komplementárnych polovíc.

Princíp renaturácie použili v roku 1960 J. Marmur a K. Schildkraut na určenie stupňa „hybridizácie“ DNA rôznych mikroorganizmov. Následne E. Bolton a B. McCarthy túto techniku ​​zdokonalili návrhom metódy takzvaných DNA agarových kolón. Táto metóda sa ukázala ako nevyhnutná pri štúdiu stupňa homológie nukleotidovej sekvencie rôznych DNA a určovaní genetického vzťahu rôznych organizmov. Denaturácia DNA objavená Dotym v kombinácii s chromatografiou na metylovanom albumíne a centrifugáciou v hustotnom gradiente, ktorú opísali J. Mandel a A. Hershey * (1960) (metóda bola vyvinutá v roku 1957 M. Meselsonom, F. Stahlom a D. Winogradom). široko používané na separáciu, izoláciu a analýzu jednotlivých komplementárnych reťazcov DNA. Napríklad W. Szybalski (USA), používajúci tieto techniky na separáciu lambda fágovej DNA, v rokoch 1967 - 1969 ukázal, že oba fágové reťazce sú geneticky aktívne, a nie iba jeden , ako to bolo všeobecne akceptované (S. Spigelman, 1961). Je potrebné poznamenať, že po prvýkrát myšlienku genetického významu oboch reťazcov DNA fágu lambda vyjadril v ZSSR S. E. Bresler (1961).

* (Za prácu o genetike baktérií a vírusov boli A. Hershey spolu s M. Delbrückom a S. Luriou ocenení v roku 1969 Nobelovou cenou.)

Na pochopenie organizácie a funkčnej aktivity genómu je mimoriadne dôležité určiť nukleotidovú sekvenciu DNA. Hľadanie metód na takéto stanovenie prebieha v mnohých laboratóriách po celom svete. V USA sa M. Beer a jeho kolegovia pokúšali stanoviť sekvenciu DNA pomocou elektrónovej mikroskopie od konca 50. rokov, no zatiaľ neúspešne. Začiatkom 50-tych rokov z prvých prác Sinsheimera, Chargaffa a iných výskumníkov o enzymatickej degradácii DNA sa zistilo, že rôzne nukleotidy v molekule DNA sú distribuované, aj keď nie chaoticky, ale nerovnomerne. Podľa anglického chemika K. Bartona (1961) sa pyrimidíny (viac ako 70 %) koncentrujú najmä vo forme zodpovedajúcich blokov. A. L. Mazin a B. F. Vanyushin (1968 - 1969) zistili, že rôzne DNA majú rôzny stupeň blokovania pyrimidínu a že v DNA živočíšnych organizmov sa výrazne zvyšuje, keď sa pohybujú z nižšieho na vyššie. Evolúcia organizmov sa teda odráža v štruktúre ich genómov. Preto je pre pochopenie evolučného procesu ako celku mimoriadne dôležité porovnávacie štúdium štruktúry nukleových kyselín. Analýza štruktúry biologicky dôležitých polymérov a predovšetkým DNA je mimoriadne dôležitá pre riešenie mnohých konkrétnych problémov fylogenetiky a taxonómie.

Je zaujímavé poznamenať, že anglický fyziológ E. Lankester, ktorý študoval hemoglobíny mäkkýšov a predvídal myšlienky molekulárnej biológie presne pred 100 rokmi, napísal: „Chemické rozdiely medzi rôznymi druhmi a rodmi zvierat a rastlín sú rovnako dôležité pre objasnenie históriu ich vzniku ako rozdiely v ich forme. Ak by sme dokázali jasne stanoviť rozdiely v molekulárnej organizácii a fungovaní organizmov, dokázali by sme oveľa lepšie pochopiť pôvod a vývoj rôznych organizmov ako na základe morfologických pozorovaní." Význam biochemického výskumu pre taxonómiu zdôraznil aj V.L. Komarov, ktorý napísal, že „základom všetkých, aj čisto morfologických znakov, na základe ktorých klasifikujeme a zakladáme druhy, sú práve biochemické rozdiely“**.

* (E. R. Lankester. Uber das Vorcommen von Hemoglobin in den Muskeln der Mollusken und die Verbreitung desselben in den lebendigen Organismen.- "Pfluger"s Archiv fur die gesammte Physiol., 1871, Bd 4, 319.)

** (V. L. Komárov. Vybrané práce, zväzok 1. M.-L., Vydavateľstvo Akadémie vied ZSSR, 1945, s. 331.)

Už v 20. rokoch 20. storočia A. V. Blagoveščenskij a S. L. Ivanov u nás podnikli prvé kroky k objasneniu niektorých otázok evolúcie a systematiky organizmov na základe porovnávacej analýzy ich biochemického zloženia (pozri kapitolu 2). Porovnávacia analýza štruktúry proteínov a nukleových kyselín sa v súčasnosti stáva čoraz hmatateľnejšou pomôckou pre taxonómov (pozri kapitolu 21). Táto metóda molekulárnej biológie umožňuje nielen objasniť postavenie jednotlivých druhov v systéme, ale núti nás aj nový pohľad na samotné princípy klasifikácie organizmov a niekedy aj prehodnotenie celého systému ako celku, ako sa to stalo , napríklad s taxonómiou mikroorganizmov. Nepochybne v budúcnosti bude analýza štruktúry genómu zaujímať ústredné miesto v chemosystematike organizmov.

Rozlúštenie mechanizmov replikácie a transkripcie DNA malo veľký význam pre rozvoj molekulárnej biológie (pozri kapitolu 24).

Biosyntéza bielkovín

Dôležitý posun v riešení problému biosyntézy bielkovín je spojený s pokrokom v štúdiu nukleových kyselín. V roku 1941 T. Kasperson (Švédsko) a v roku 1942 J. Brachet (Belgicko) upozornili na skutočnosť, že tkanivá s aktívnou syntézou bielkovín obsahujú zvýšené množstvo RNA. Dospeli k záveru, že ribonukleové kyseliny hrajú rozhodujúcu úlohu v syntéze bielkovín. V roku 1953 sa zdalo, že E. Gale a D. Fox získali priamy dôkaz o priamej účasti RNA na biosyntéze proteínov: podľa ich údajov ribonukleáza výrazne potláčala inkorporáciu aminokyselín do lyzátov bakteriálnych buniek. Podobné údaje získali V. Allfrey, M. Deli a A. Mirsky (1953) o pečeňových homogenátoch. Neskôr E. Gale opustil správnu myšlienku, ktorú vyslovil o vedúcej úlohe RNA v syntéze bielkovín, mylne sa domnievajúc, že ​​k aktivácii syntézy bielkovín v bezbunkovom systéme dochádza pod vplyvom nejakej inej látky neznámej povahy. V roku 1954 P. Zámečník, D. Littlefield, R. B. Hesin-Lurie a ďalší zistili, že k najaktívnejšiemu inkorporovaniu aminokyselín dochádza vo frakciách subcelulárnych častíc – mikrozómoch, bohatých na RNA. P. Zámečník a E. Keller (1953 - 1954) zistili, že inkorporácia aminokyselín sa výrazne zvýšila v prítomnosti supernatantu v podmienkach regenerácie ATP. P. Siekewitz (1952) a M. Hogland (1956) izolovali zo supernatantu proteínovú frakciu (frakcia pH 5), ktorá bola zodpovedná za ostrú stimuláciu inkorporácie aminokyselín do mikrozómov. Spolu s proteínmi bola v supernatante nájdená špeciálna trieda RNA s nízkou molekulovou hmotnosťou, teraz nazývaná transferová RNA (tRNA). V roku 1958 Hoagland a Zamecnik, ako aj P. Berg, R. Sweet a F. Allen a mnohí ďalší výskumníci zistili, že každá aminokyselina vyžaduje svoj vlastný špeciálny enzým, ATP a špecifickú tRNA, aby bola aktivovaná. Ukázalo sa, že tRNA plnia výlučne funkciu adaptérov, t.j. zariadení, ktoré nachádzajú miesto zodpovedajúcej aminokyseliny vo formujúcej sa proteínovej molekule na nukleovej matrici (mRNA). Tieto štúdie plne potvrdili adaptorovú hypotézu F. Cricka (1957), ktorá predpokladala existenciu polynukleotidových adaptérov v bunke nevyhnutných pre správne usporiadanie aminokyselinových zvyškov syntetizovaného proteínu na nukleárnej matrici. Oveľa neskôr francúzsky vedec F. Chapville (1962) v laboratóriu F. Lipmana (Nobelova cena, 1953) v USA veľmi dômyselne a jednoznačne ukázal, že umiestnenie aminokyseliny v molekule syntetizovaného proteínu je úplne určené tzv. špecifickú tRNA, ku ktorej je pripojený. Crickova hypotéza adaptéra bola vyvinutá v prácach Hoaglanda a Zámečníka.

Do roku 1958 sa stali známymi tieto hlavné štádiá syntézy proteínov: 1) aktivácia aminokyseliny špecifickým enzýmom z „frakcie pH 5“ v prítomnosti ATP za vzniku aminoacyladenylátu; 2) pripojenie aktivovanej aminokyseliny na špecifickú tRNA s uvoľnením adenozínmonofosfátu (AMP); 3) väzba aminoacyl-tRNA (tRNA nabitá aminokyselinou) na mikrozómy a inkorporácia aminokyselín do proteínu s uvoľnením tRNA. Hoagland (1958) poznamenal, že posledný krok v syntéze proteínov vyžaduje guanozíntrifosfát (GTP).

Transfer RNA a génová syntéza

Po objavení tRNA sa začalo aktívne hľadanie ich frakcionácie a určenia nukleotidovej sekvencie. Najväčší úspech dosiahol americký biochemik R. Holley. V roku 1965 určil štruktúru alanínovej tRNA z kvasiniek. Holly pomocou ribonukleáz (guanyl RNázy a pankreatickej RNázy) rozdelila molekulu nukleovej kyseliny na niekoľko fragmentov, v každom z nich samostatne určila nukleotidovú sekvenciu a následne zrekonštruovala sekvenciu celej molekuly alanínovej tRNA. Tento spôsob analýzy nukleotidovej sekvencie sa nazýva bloková metóda. Hollého zásluha spočívala najmä v tom, že sa naučil deliť molekulu RNA nielen na malé kúsky, ako to robili mnohí pred ním, ale aj na veľké fragmenty (štvrtiny a polovice). To mu poskytlo príležitosť správne zostaviť jednotlivé malé kúsky dohromady a tak znovu vytvoriť kompletnú nukleotidovú sekvenciu celej molekuly tRNA (Nobelova cena, 1968).

Táto technika bola okamžite prijatá mnohými laboratóriami po celom svete. V priebehu nasledujúcich dvoch rokov bola v ZSSR a v zahraničí dešifrovaná primárna štruktúra niekoľkých tRNA. A. A. Baev (1967) a spolupracovníci prvýkrát stanovili nukleotidovú sekvenciu v kvasinkovej valínovej tRNA. K dnešnému dňu sa študovalo viac ako tucet rôznych individuálnych tRNA. Jedinečný rekord v určovaní nukleotidovej sekvencie zaznamenali v Cambridge F. Sanger a G. Brownlee. Títo výskumníci vyvinuli prekvapivo elegantnú metódu na separáciu oligonukleotidov a určili sekvenciu takzvanej 5S (ribozomálnej) RNA z buniek Escherichia coli (1968). Táto RNA pozostáva zo 120 nukleotidových zvyškov a na rozdiel od tRNA neobsahuje ďalšie minoritné bázy, ktoré výrazne uľahčujú analýzu nukleotidovej sekvencie a slúžia ako jedinečné orientačné body pre jednotlivé fragmenty molekuly. V súčasnosti vďaka použitiu metódy Sanger a Brownlee úspešne napredujú práce na štúdiu sekvencie dlhých ribozomálnych RNA a niektorých vírusových RNA v laboratóriu J. Ebela (Francúzsko) a ďalších výskumníkov.

A. A. Baev a spolupracovníci (1967) zistili, že valínová tRNA rozrezaná na polovicu obnovuje svoju makromolekulárnu štruktúru v roztoku a napriek defektu v primárnej štruktúre má funkčnú aktivitu pôvodnej (natívnej) molekuly. Tento prístup - rekonštrukcia rezanej makromolekuly po odstránení určitých fragmentov - sa ukázal ako veľmi sľubný. V súčasnosti sa široko používa na objasnenie funkčnej úlohy jednotlivých sekcií určitých tRNA.

V posledných rokoch sa dosiahol veľký úspech pri získavaní kryštalických preparátov jednotlivých tRNA. Viacerým laboratóriám v USA a Anglicku sa už podarilo vykryštalizovať veľa tRNA. To umožnilo študovať štruktúru tRNA pomocou rôntgenovej difrakčnej analýzy. V roku 1970 predstavil R. Bock prvé röntgenové difrakčné obrazce a trojrozmerné modely niekoľkých tRNA, ktoré vytvoril na University of Wisconsin. Tieto modely pomáhajú určiť lokalizáciu jednotlivých funkčne aktívnych miest v tRNA a pochopiť základné princípy fungovania týchto molekúl.

Najdôležitejšie pre odhalenie mechanizmu syntézy bielkovín a vyriešenie problému špecifickosti tohto procesu bolo rozlúštenie podstaty genetického kódu (pozri kapitolu 24), ktorý možno bez preháňania považovať za popredné miesto prírodovedy 20. storočia.

Objav primárnej štruktúry tRNA R. Hollyho dal podnet k práci G. Korana * (USA) na syntéze oligonukleotidov a nasmeroval ich k syntéze špecifickej biologickej štruktúry - molekuly DNA kódujúcej alanínovú tRNA. Prvé kroky, ktoré podnikla Korana pred takmer 15 rokmi v chemickej syntéze krátkych oligonukleotidov, vyvrcholili v roku 1970 prvou vykonanou génovou syntézou. Korana a jeho spolupracovníci najskôr chemicky syntetizovali krátke fragmenty dlhé 8-12 nukleotidových zvyškov z jednotlivých nukleotidov. Tieto fragmenty s danou nukleotidovou sekvenciou spontánne vytvorili dvojvláknové komplementárne kúsky s presahom 4 až 5 nukleotidov. Tieto hotové kusy sa potom spojili do jedného konca v správnom poradí pomocou enzýmu DNA ligázy. Na rozdiel od replikácie molekúl DNA sa teda podľa A. Kornberga ** (pozri kapitolu 24) podarilo Korane podľa vopred určeného programu znovu vytvoriť prirodzenú dvojvláknovú molekulu DNA v súlade so sekvenciou tRNA opísanou napr. Svätý. Podobným spôsobom sa teraz pracuje na syntéze ďalších génov (M. N. Kolosov, Z. A. Shabarova, D. G. Knorre, 1970 - 1975).

* (Za výskum genetického kódu boli G. Korana a M. Nirenberg v roku 1968 ocenení Nobelovou cenou.)

** (Za objav polymerázy a syntézy DNA A. Kornberg a za syntézu RNA dostal S. Ochoa v roku 1959 Nobelovu cenu.)

Mikrozómy, ribozómy, preklad

V polovici 50. rokov sa verilo, že mikrozómy sú centrom syntézy bielkovín v bunke. Termín mikrozómy prvýkrát zaviedol v roku 1949 A. Claude na označenie frakcie malých granúl. Neskôr sa ukázalo, že za syntézu proteínov nie je zodpovedná celá frakcia mikrozómov pozostávajúca z membrán a granúl, ale iba malé častice ribonukleoproteínu. Tieto častice pomenoval R. Roberts v roku 1958 ako ribozómy.

Klasické štúdie bakteriálnych ribozómov uskutočnili v rokoch 1958 - 1959 A. Tissier a J. Watson. Ukázalo sa, že bakteriálne ribozómy sú o niečo menšie ako rastlinné a živočíšne. J. Littleton (1960), M. Clark (1964) a E. N. Svetailo (1966) ukázali, že ribozómy chloroplastov vyšších rastlín a mitochondrií patria k bakteriálnemu typu. A. Tissier a iní (1958) zistili, že ribozómy sa disociujú na dve nerovnaké podjednotky, z ktorých každá obsahuje jednu molekulu RNA. Koncom 50. rokov sa verilo, že každá molekula ribozomálnej RNA pozostáva z niekoľkých krátkych fragmentov. A.S. Spirin však ako prvý v roku 1960 ukázal, že RNA v subčasticiach je reprezentovaná súvislou molekulou. D. Waller (1960), ktorý oddelil ribozomálne proteíny pomocou elektroforézy na škrobovom géli, zistil, že sú veľmi heterogénne. Spočiatku mnohí pochybovali o Wallerových údajoch, pretože sa zdalo, že ribozomálny proteín by mal byť prísne homogénny, ako napríklad proteín TMV. V súčasnosti sa ako výsledok výskumu D. Wallera, R. Trouta, P. Trauba a ďalších biochemikov zistilo, že samotné zloženie ribozomálnych častíc zahŕňa viac ako 50 proteínov, ktoré sú v štruktúre úplne odlišné. V roku 1963 A.S. Spirin ako prvý rozvinul ribozomálne subčastice a ukázal, že ribozómy sú kompaktne skrútené ribonukleoproteínové vlákno, ktoré sa môže za určitých podmienok rozvinúť. V rokoch 1967-1968 M. Nomura kompletne zrekonštruoval biologicky aktívnu subčasticu z ribozomálnej RNA a proteínu a dokonca získal ribozómy, v ktorých proteín a RNA patrili rôznym mikroorganizmom.

Dodnes je úloha ribozomálnej RNA nejasná. Predpokladá sa, že ide o unikátnu špecifickú matricu, na ktorej pri tvorbe ribozomálnej častice nachádza každý z početných ribozomálnych proteínov presne definované miesto (A. S. Spirin, 1968).

A. Rich (1962) objavil agregáty niekoľkých ribozómov navzájom spojených reťazcom mRNA. Tieto komplexy sa nazývali polyzómy. Objav polyzómov umožnil Richovi a Watsonovi (1963) navrhnúť, že k syntéze polypeptidového reťazca dochádza na ribozóme, ktorý sa podľa všetkého pohybuje pozdĺž reťazca mRNA. Keď sa ribozóm pohybuje pozdĺž reťazca mRNA v častici, informácia sa prečíta a vytvorí sa polypeptidový reťazec proteínu a na uvoľnený čítaný koniec mRNA sa striedavo pripájajú nové ribozómy. Z údajov Richa a Watsona vyplynulo, že význam polyzómov v bunke spočíva v masívnej produkcii proteínu postupným čítaním matrice niekoľkými ribozómami naraz.

Výsledkom výskumu M. Nirenberga, S. Ochoa, F. Lipmana, G. Korana a iných v rokoch 1963 - 1970. Je známe, že spolu s mRNA, ribozómami, ATP a aminoacyl-tRNA sa na procese translácie podieľa veľké množstvo rôznych faktorov a samotný proces translácie možno podmienečne rozdeliť do troch štádií - iniciácia, samotná translácia a ukončenie.

Iniciácia translácie znamená syntézu prvej peptidovej väzby v komplexe ribozóm - templátový polynukleotid - aminoacyl-tRNA. Nie každá aminoacyl-tRNA, ale formylmetionyl-tRNA má takúto iniciačnú aktivitu. Táto látka bola prvýkrát izolovaná v roku 1964 F. Sangerom a K. Markerom. S. Bretcher a K. Marker (1966) ukázali, že iniciačná funkcia formylmetionyl-tRNA je spôsobená jej zvýšenou afinitou k peptidylovému centru ribozómu. Pre začiatok translácie sú mimoriadne dôležité aj niektoré proteínové iniciačné faktory, ktoré boli izolované v laboratóriách S. Ochoa, F. Gro a iných výskumných centier. Po vytvorení prvej peptidovej väzby v ribozóme začína vlastná translácia, t.j. postupná adícia aminoacylového zvyšku na C-koniec polypeptidu. Mnohé detaily procesu prekladu študovali K. Monroe a J. Bishop (Anglicko), I. Rykhlik a F. Schorm (Československo), F. Lipman, M. Bretcher, V. Gilbert (USA) a ďalší bádatelia. V roku 1968 A.S. Spirin navrhol originálnu hypotézu na vysvetlenie mechanizmu ribozómu. Hnacím mechanizmom, ktorý zabezpečuje všetky priestorové pohyby tRNA a mRNA počas translácie, je periodické otváranie a zatváranie ribozomálnych subčastíc. Koniec translácie je zakódovaný v samotnej čítacej matici, ktorá obsahuje stop kodóny. Ako ukázal S. Brenner (1965 - 1967), takýmito kodónmi sú triplety UAA, UAG a UGA. M. Capecchi (1967) tiež identifikoval špeciálne proteínové terminačné faktory. A. S. Spirin a L. P. Gavrilova opísali takzvanú „neenzymatickú“ syntézu proteínov v ribozómoch (1972 - 1975) bez účasti proteínových faktorov. Tento objav je dôležitý pre pochopenie pôvodu a vývoja biosyntézy bielkovín.

Regulácia aktivity génov a proteínov

Po probléme špecifickosti syntézy proteínov prišiel v molekulárnej biológii na prvé miesto problém regulácie syntézy proteínov, alebo, čo je to isté, regulácie aktivity génov.

Funkčná disparita buniek a s tým spojená represia a aktivácia génov dlho priťahovali pozornosť genetikov, ale až donedávna zostával skutočný mechanizmus kontroly aktivity génov neznámy.

Prvé pokusy vysvetliť regulačnú aktivitu génov súviseli so štúdiom histónových proteínov. Aj manželia Steadmanovci * na začiatku 40. rokov XX. vyjadril myšlienku, že práve históny môžu hrať hlavnú úlohu v tomto fenoméne. Následne získali prvé jasné údaje o rozdieloch v chemickej povahe histónových proteínov. V súčasnosti sa počet faktov podporujúcich túto hypotézu každým rokom zvyšuje.

* (E. Stedman, E. Stedman. Základné bielkoviny bunkových jadier.- Fylozof. Trans. Roy. Soc. Londýn, 1951, v. 235, 565 - 595.)

Zároveň sa hromadí čoraz väčšie množstvo údajov, ktoré naznačujú, že regulácia génovej aktivity je oveľa zložitejší proces ako jednoduchá interakcia génových oblastí s molekulami histónového proteínu. V rokoch 1960-1962 v laboratóriu R. B. Khesin-Lurie sa zistilo, že gény fágov sa začínajú čítať nesúbežne: gény fága T2 možno rozdeliť na skoré gény, ktorých fungovanie sa vyskytlo v prvých minútach infekcie bakteriálna bunka a neskoré gény, ktoré začali syntetizovať mRNA po dokončení práce skorých génov.

V roku 1961 navrhli francúzski biochemici F. Jacob a J. Monod schému regulácie génovej aktivity, ktorá zohrala výnimočnú úlohu pri pochopení regulačných mechanizmov buniek vo všeobecnosti. Podľa Jacobovej a Monodovej schémy sa v DNA okrem štrukturálnych (informačných) génov nachádzajú aj gény regulátora a gény operátora. Regulačný gén kóduje syntézu špecifickej látky – represora, ktorý môže byť pripojený k induktoru aj k operátorovému génu. Operátorový gén je spojený so štrukturálnymi génmi a regulačný gén sa nachádza v určitej vzdialenosti od nich. Ak v prostredí nie je žiadny induktor, napríklad laktóza, potom sa represor syntetizovaný regulačným génom naviaže na operátorový gén a jeho zablokovaním vypne činnosť celého operónu (blok štrukturálnych génov spolu s operátorom ktorý ich ovláda). Za týchto podmienok nedochádza k tvorbe enzýmov. Ak sa v prostredí objaví induktor (laktóza), potom sa produkt regulačného génu - represor - naviaže na laktózu a odstráni blok z génu operátora. V tomto prípade je možná práca štrukturálneho génu kódujúceho syntézu enzýmu a enzým (laktóza) sa objavuje v prostredí.

Podľa Jacoba a Monoda sa táto regulačná schéma vzťahuje na všetky adaptívne enzýmy a môže sa vyskytnúť tak počas represie, keď je tvorba enzýmu potlačená nadbytkom reakčného produktu, ako aj počas indukcie, keď zavedenie substrátu spôsobí syntézu. enzýmu. Za výskum regulácie génovej aktivity získali Jacob a Monod v roku 1965 Nobelovu cenu.

Spočiatku sa táto schéma zdala príliš pritiahnutá. Neskôr sa však ukázalo, že génová regulácia podľa tohto princípu prebieha nielen v baktériách, ale aj v iných organizmoch.

Od roku 1960 zaujímajú popredné miesto v molekulárnej biológii štúdie organizácie genómu a štruktúry chromatínu v eukaryotických organizmoch (J. Bonner, R. Britten, W. Allfrey, P. Walker, Yu. S. Chentsov, I. B. Zbarsky atď.). ) a o regulácii transkripcie (A. Mirsky, G. P. Georgiev, M. Bernstiel, D. Goll, R. Tsanev, R. I. Salganik). Povaha represora zostala dlho neznáma a kontroverzná. V roku 1968 M. Ptashne (USA) ukázal, že represorom je proteín. Izoloval ho v laboratóriu J. Watsona a zistil, že represor má skutočne afinitu k induktoru (laktóze) a zároveň „rozpoznáva“ operátorový gén lac operónu a špecificky sa naň viaže.

V posledných 5 - 7 rokoch boli získané údaje o prítomnosti ďalšej kontrolnej bunky génovej aktivity - promótora. Ukázalo sa, že v blízkosti miesta operátora, na ktoré je naviazaný produkt syntetizovaný na génovom regulátore - proteínová substancia represora, sa nachádza ďalšie miesto, ktoré by malo byť tiež klasifikované ako člen regulačného systému. génovej aktivity. Na toto miesto je pripojená proteínová molekula enzýmu RNA polymeráza. V promótorovej oblasti musí nastať vzájomné rozpoznanie jedinečnej nukleotidovej sekvencie v DNA a špecifickej konfigurácie proteínu RNA polymerázy. Proces čítania genetickej informácie s danou génovou sekvenciou operónu susediaceho s promótorom bude závisieť od účinnosti rozpoznávania.

Okrem schémy, ktorú opísali Jacob a Monod, existujú v bunke aj iné mechanizmy génovej regulácie. F. Jacob a S. Brenner (1963) zistili, že regulácia replikácie bakteriálnej DNA je určitým spôsobom riadená bunkovou membránou. Jacobove (1954) experimenty na indukcii rôznych profágov presvedčivo ukázali, že pod vplyvom rôznych mutagénnych faktorov v bunke lyzogénnych baktérií začína selektívna replikácia profágového génu a replikácia hostiteľského genómu je blokovaná. V roku 1970 F. Bell oznámil, že malé molekuly DNA môžu prejsť do cytoplazmy z jadra a tam sa prepísať.

Regulácia génovej aktivity sa teda môže uskutočňovať na úrovni replikácie, transkripcie a translácie.

Významný pokrok sa dosiahol v štúdiu regulácie nielen syntézy enzýmov, ale aj ich aktivity. Na fenomén regulácie enzýmovej aktivity v bunkách poukázali už v 50. rokoch A. Novik a L. Szilard. G. Umbarger (1956) zistil, že v bunke existuje veľmi racionálny spôsob potlačenia aktivity enzýmu konečným produktom spätnoväzbového reťazca reakcií. Ako zistili J. Monod, J. Changer, F. Jacob, A. Pardee a ďalší výskumníci (1956 - 1960), regulácia aktivity enzýmov sa môže uskutočňovať podľa alosterického princípu. Enzým alebo jedna z jeho podjednotiek má okrem svojej afinity k substrátu aj afinitu k jednému z produktov reakčného reťazca. Pod vplyvom takéhoto signálneho produktu enzým natoľko zmení svoju konformáciu, že stratí aktivitu. Tým sa hneď na začiatku vypne celý reťazec enzymatických reakcií. Na významnú úlohu konformačných zmien proteínov v enzymatických reakciách a v určitom zmysle na prítomnosť alosterického efektu poukázali D. Wiman a R. Woodward (1952; laureát Nobelovej ceny, 1965).

Štruktúra a funkcia bielkovín

Výsledkom práce T. Osbornea, G. Hoffmeistera, A. Gurbera, F. Schulza a mnohých ďalších na konci 19. storočia. Mnohé živočíšne a rastlinné bielkoviny boli získané v kryštalickej forme. Približne v rovnakom čase sa pomocou rôznych fyzikálnych metód stanovili molekulové hmotnosti určitých proteínov. V roku 1891 teda A. Sabaneev a N. Alexandrov uviedli, že molekulová hmotnosť ovalbumínu je 14 000; v roku 1905 E. Reid zistil, že molekulová hmotnosť hemoglobínu je 48 000. Polymérnu štruktúru proteínov objavili v roku 1871 G. Glasivetz a D. Haberman. Myšlienku peptidových väzieb jednotlivých aminokyselinových zvyškov v proteínoch vyjadril T. Curtius (1883). Práca o chemickej kondenzácii aminokyselín (E. Schaal, 1871; G. Schiff, 1897; L. Balbiano a D. Traschiatti, 1900) a syntéze heteropolypeptidov (E. Fischer, 1902 - 1907, Nobelova cena, 1902) viedol k vývoju základných princípov chemickej štruktúry bielkovín.

Prvý kryštalický enzým (ureázu) získal v roku 1926 J. Sumner (Nobelova cena, 1946) a v roku 1930 J. Northrop (Nobelova cena, 1946) dostal kryštalický pepsín. Po tejto práci sa ukázalo, že enzýmy sú bielkovinovej povahy. V roku 1940 M. Kunitz izoloval kryštalickú RNázu. Do roku 1958 už bolo známych viac ako 100 kryštalických enzýmov a viac ako 500 enzýmov izolovaných v nekryštalickej forme. Výroba vysoko purifikovaných preparátov jednotlivých proteínov prispela k rozlúšteniu ich primárnej štruktúry a makromolekulárnej organizácie.

Veľký význam pre rozvoj molekulárnej biológie všeobecne a genetiky človeka zvlášť mal objav L. Paulinga (1940) abnormálneho hemoglobínu S, izolovaného z erytrocytov ľudí s ťažkým dedičným ochorením – kosáčikovitou anémiou. V rokoch 1955-1957 V. Ingram použil na analýzu produktov hydrolýzy hemoglobínu S alkáliou a trypsínom metódu „odtlačkov prstov“ vyvinutú F. Sangerom (škvrny tvorené jednotlivými peptidmi pri chromatografii na papieri). V roku 1961 Ingram uviedol, že hemoglobín S sa líši od normálneho hemoglobínu iba povahou jedného aminokyselinového zvyšku: v normálnom hemoglobíne je zvyšok kyseliny glutámovej na siedmej pozícii reťazca a v hemoglobíne S je valínový zvyšok. Tak sa plne potvrdil Paulingov predpoklad (1949), že kosáčikovitá anémia je choroba molekulárnej povahy. Zdedená zmena len jedného aminokyselinového zvyšku v každej polovici makromolekuly hemoglobínu vedie k tomu, že hemoglobín pri nízkych koncentráciách kyslíka stráca schopnosť ľahko sa rozpúšťať a začína kryštalizovať, čo vedie k narušeniu bunkovej štruktúry. Tieto štúdie jasne ukázali, že proteínová štruktúra je presne definovaná aminokyselinová sekvencia, ktorá je kódovaná v genóme. Výnimočný význam primárnej štruktúry proteínu pri tvorbe unikátnej biologicky aktívnej konformácie makromolekuly doložila práca K. Anfinsena (1951). Anfinsen ukázal, že biologicky aktívna makroštruktúra pankreatickej ribonukleázy, stratená v dôsledku redukcie, je vopred určená sekvenciou aminokyselín a môže sa spontánne objaviť počas oxidácie SH skupín cysteínových zvyškov s tvorbou disulfidových krížových väzieb v striktne definované miesta v peptidovom reťazci enzýmu.

Doteraz bol podrobne študovaný mechanizmus účinku veľkého množstva enzýmov a bola stanovená štruktúra mnohých proteínov.

V roku 1953 F. Sanger stanovil aminokyselinovú sekvenciu inzulínu. :Tento proteín pozostáva z dvoch polypeptidových reťazcov spojených dvoma disulfidovými krížovými väzbami. Jeden z reťazcov obsahuje iba 21 aminokyselinových zvyškov a druhý - 30 zvyškov. Sanger strávil asi 10 rokov dešifrovaním štruktúry tohto relatívne jednoduchého proteínu. V roku 1958 mu bola za tento výnimočný výskum udelená Nobelova cena. Po vytvorení automatického analyzátora aminokyselín W. Steinom a S. Moorom (1957) sa identifikácia produktov čiastočnej hydrolýzy proteínov výrazne urýchlila. Stein a Moore o tom informovali už v roku 1960. že dokázali určiť sekvenciu ribonukleázy, ktorej peptidový reťazec predstavuje 124 aminokyselinových zvyškov. V tom istom roku v laboratóriu G. Schramma v Tübingene (Nemecko) F. Anderer a ďalší určili sekvenciu aminokyselín v proteíne TMV. Potom sa určila sekvencia aminokyselín v myoglobíne (A. Edmunson) a a- a p-reťazcoch ľudského hemoglobínu (G. Braunitzer, E. Schroeder atď.), lyzozýme z bielka kuracieho vaječného bielka (J. Jollet, D. Cayfield). V roku 1963 F. Schorm a B. Keil (Československo) stanovili sekvenciu aminokyselín v molekule chymotrypsinogénu. V tom istom roku bola stanovená sekvencia aminokyselín trypsinogénu (F. Schorm, D. Walsh). V roku 1965 K. Takahashi stanovil primárnu štruktúru T1 ribonukleázy. Potom sa určili aminokyselinové sekvencie pre niekoľko ďalších proteínov.

Ako je známe, konečným dôkazom správnosti definície konkrétnej štruktúry je jej syntéza. V roku 1969 R. Merifield (USA) ako prvý uskutočnil chemickú syntézu pankreatickej ribonukleázy. Pomocou metódy syntézy na pevnej fáze, ktorú vyvinul, Merifield pridával jednu aminokyselinu za druhou do reťazca v súlade so sekvenciou, ktorú opísali Stein a Moore. Vďaka tomu získal proteín, ktorého kvality boli identické s pankreatickou ribonukleázou A. Za objav štruktúry ribonukleázy dostali V. Stein, S. Moore a K. Anfinsen v roku 1972 Nobelovu cenu. Táto syntéza prírodného proteínu otvára veľké vyhliadky, čo naznačuje možnosť vytvorenia akýchkoľvek proteínov podľa vopred naplánovanej sekvencie.

Z röntgenových difrakčných štúdií W. Astburyho (1933) vyplynulo, že peptidové reťazce proteínových molekúl sú skrútené alebo naskladané nejakým presne definovaným spôsobom. Odvtedy mnohí autori vyjadrili rôzne hypotézy o metódach skladania proteínových reťazcov, ale až do roku 1951 zostali všetky modely špekulatívnymi konštrukciami, ktoré nezodpovedali experimentálnym údajom. V roku 1951 L. Pauling a R. Corey publikovali sériu brilantných prác, v ktorých bola konečne sformulovaná teória sekundárnej štruktúry bielkovín – teória α-helixu. Spolu s tým sa tiež zistilo, že proteíny majú tiež terciárnu štruktúru: a-helix peptidového reťazca môže byť zložený určitým spôsobom, čím sa vytvorí pomerne kompaktná štruktúra.

V roku 1957 J. Kendrew a jeho kolegovia prvýkrát navrhli trojrozmerný model štruktúry myoglobínu. Tento model sa potom niekoľko rokov zdokonaľoval, až kým sa v roku 1961 neobjavila záverečná práca charakterizujúca priestorovú štruktúru tohto proteínu. V roku 1959 M. Perutz a spolupracovníci stanovili trojrozmernú štruktúru hemoglobínu. Výskumníci strávili na tejto práci viac ako 20 rokov (prvé röntgenové snímky hemoglobínu získal Perutz v roku 1937). Keďže molekula hemoglobínu pozostáva zo štyroch podjednotiek, rozlúštením jej organizácie bol Perutz prvý, kto opísal kvartérnu štruktúru proteínu. Za prácu na určovaní trojrozmernej štruktúry proteínov získali Kendrew a Perutz v roku 1962 Nobelovu cenu.

Perutzovo vytvorenie priestorového modelu štruktúry hemoglobínu POVOLENÉ. priblížiť sa k pochopeniu mechanizmu fungovania tohto proteínu, o ktorom je známe, že transportuje kyslík v živočíšnych bunkách. Ešte v roku 1937 F. Gaurowitz dospel k záveru, že interakcia hemoglobínu s kyslíkom a vzduchom by mala byť sprevádzaná zmenou štruktúry proteínu. V 60. rokoch Perutz a jeho kolegovia objavili znateľný posun reťazcov hemoglobínu po jeho oxidácii, spôsobený posunom atómov železa v dôsledku väzby s kyslíkom. Na tomto základe sa vytvorili predstavy o „dýchaní“ proteínových makromolekúl.

V roku 1960 D. Phillips a jeho spolupracovníci začali so štúdiom röntgenovej difrakcie molekuly lyzozýmu. Do roku 1967 viac-menej presne stanovili podrobnosti o organizácii tohto proteínu a lokalizácii jednotlivých atómov v jeho molekule. Okrem toho Phillips zistil povahu pridania lyzozýmu do substrátu (triacetylglukózamín). To umožnilo obnoviť mechanizmus fungovania tohto enzýmu. Znalosť primárnej štruktúry a makromolekulovej organizácie teda umožnila nielen zistiť povahu aktívnych centier mnohých enzýmov, ale aj plne odhaliť mechanizmus fungovania týchto makromolekúl.

Použitie metód elektrónovej mikroskopie pomohlo odhaliť princípy makromolekulárnej organizácie takých zložitých proteínových útvarov, akými sú vlákna kolagénu, fibrinogénu, kontraktilné svalové fibrily a pod. Koncom 50. rokov boli navrhnuté modely svalového kontraktilného aparátu. Výnimočný význam pre pochopenie mechanizmu svalovej kontrakcie mal objav ATPázovej aktivity myozínu V. A. Engelhardtom a M. N. Lyubimovou (1939). To znamenalo, že základom aktu svalovej kontrakcie bola zmena fyzikálno-chemických vlastností a makromolekulárnej organizácie kontraktilného proteínu pod vplyvom kyseliny adenozíntrifosforečnej (pozri tiež kapitolu 11).

Na pochopenie princípov zostavovania biologických štruktúr boli nevyhnutné virologické štúdie (pozri kapitolu 25).

Nevyriešené problémy

Hlavné pokroky v modernej molekulárnej biológii sa dosiahli najmä vďaka štúdiu nukleových kyselín. Ani v tejto oblasti však ešte nie sú vyriešené všetky problémy. Najmä dešifrovanie celej nukleotidovej sekvencie genómu bude vyžadovať veľké úsilie. Tento problém je zas neoddeliteľne spojený s problémom heterogenity DNA a vyžaduje si vývoj nových pokročilých metód frakcionácie a izolácie jednotlivých molekúl z celkového genetického materiálu bunky.

Doteraz sa úsilie sústreďovalo hlavne na samostatné štúdium proteínov a nukleových kyselín. V bunke sú tieto biopolyméry navzájom neoddeliteľne spojené a fungujú najmä vo forme nukleoproteínov. Preto je teraz potreba študovať interakciu proteínov a nukleových kyselín obzvlášť akútna. Do popredia sa dostáva problém rozpoznávania určitých úsekov nukleových kyselín proteínmi. Boli už podniknuté kroky k štúdiu tejto interakcie týchto biopolymérov, bez ktorých je úplné pochopenie štruktúry a funkcií chromozómov, ribozómov a iných štruktúr nemysliteľné. Bez toho je tiež nemožné pochopiť reguláciu génovej aktivity a nakoniec dešifrovať princípy fungovania mechanizmov syntézy proteínov. Po práci Jacoba a Monoda sa objavili nové údaje o regulačnom význame membrán pri syntéze jadrového materiálu. To kladie za úlohu hlbšie štúdium úlohy membrán pri regulácii replikácie DNA. Vo všeobecnosti sa problém regulácie génovej aktivity a bunkovej aktivity vo všeobecnosti stal jedným z najdôležitejších problémov modernej molekulárnej biológie.

Súčasný stav biofyziky

Biofyzika sa rozvíjala v úzkej súvislosti s problémami molekulárnej biológie. Záujem o túto oblasť biológie bol stimulovaný na jednej strane potrebou komplexného štúdia účinkov rôznych druhov žiarenia na organizmus a na druhej strane potrebou študovať fyzikálne a fyzikálno-chemické základy životných javov vyskytujúcich sa na molekulárnej úrovni.

Získanie presných informácií o molekulárnych štruktúrach a procesoch, ktoré sa v nich vyskytujú, bolo možné vďaka použitiu nových jemných fyzikálno-chemických metód. Na základe výdobytkov elektrochémie bolo možné zlepšiť metódu merania bioelektrických potenciálov použitím iónovo selektívnych elektród (G. Eisenman, B.P. Nikolsky, Khuri, 50-60s). Čoraz častejšie sa do praxe dostáva infračervená spektroskopia (pomocou laserových prístrojov), ktorá umožňuje študovať konformačné zmeny proteínov (I. Plotnikov, 1940). Cenné informácie poskytuje aj metóda elektrónovej paramagnetickej rezonancie (E.K. Zavoisky, 1944) a biochemoluminiscenčná metóda (B.N. Tarusov et al., 1960), ktoré umožňujú najmä posudzovať transport elektrónov pri oxidačných procesoch.

V 50. rokoch už biofyzika získavala silné postavenie. Je potrebné vychovať kvalifikovaných odborníkov. Ak v roku 1911 mala v Európe katedru biofyziky iba Univerzita v Pecsi v Maďarsku, potom v roku 1973 existovali takéto katedry takmer na všetkých veľkých univerzitách.

V roku 1960 bola zorganizovaná Medzinárodná spoločnosť biofyziky. V auguste 1961 sa v Štokholme konal prvý medzinárodný biofyzikálny kongres. Druhý kongres sa konal v roku 1965 v Paríži, tretí v roku 1969 v Bostone, štvrtý v roku 1972 v Moskve.

V biofyzike sa jasne rozlišuje medzi dvoma oblasťami rôzneho obsahu – molekulárnou biofyzikou a bunkovou biofyzikou. Toto rozlíšenie dostáva aj organizačné vyjadrenie: vytvárajú sa samostatné oddelenia týchto dvoch oblastí biofyziky. Na Moskovskej univerzite vznikla prvá katedra biofyziky v roku 1953 na Fakulte biológie a pôd a o niečo neskôr Katedra biofyziky na Fyzikálnej fakulte. Katedry boli organizované podľa rovnakého princípu na mnohých iných univerzitách.

Molekulárna biofyzika

V posledných rokoch je spojenie medzi molekulárnou biofyzikou a molekulárnou biológiou čoraz silnejšie a teraz môže byť niekedy ťažké určiť, kde leží hranica medzi nimi. Pri všeobecnom útoku na problém dedičnej informácie je takáto spolupráca medzi biofyzikou a molekulárnou biológiou nevyhnutná.

Hlavným smerom výskumnej práce je štúdium fyziky nukleových kyselín - DNA a RNA. Použitie vyššie uvedených metód a predovšetkým röntgenová difrakčná analýza prispela k dešifrovaniu molekulárnej štruktúry nukleových kyselín. V súčasnosti prebieha intenzívny výskum na skúmanie správania týchto kyselín v roztokoch. Zvláštna pozornosť je venovaná konformačným prechodom špirála-coil, ktoré sa študujú zmenami viskozity, optických a elektrických parametrov. V súvislosti so štúdiom mechanizmov mutagenézy sa rozvíja výskum zameraný na štúdium vplyvu ionizujúceho žiarenia na správanie sa nukleových kyselín v roztokoch, ako aj vplyvu žiarenia na nukleové kyseliny vírusov a fágov. Vplyv ultrafialového žiarenia, o ktorom je známe, že niektoré spektrálne oblasti sú dobre absorbované nukleovými kyselinami, bol podrobený komplexnej analýze. Veľký podiel na tomto type výskumu má detekcia aktívnych radikálov nukleových kyselín a proteínov elektrónovou paramagnetickou rezonanciou. Použitie tejto metódy je spojené so vznikom celého nezávislého smeru.

Problém kódovania informácií DNA a RNA a ich prenosu počas syntézy proteínov je dlhodobo predmetom záujmu molekulárnej biofyziky a fyzici opakovane vyjadrili k tejto záležitosti určité úvahy (E. Schrödinger, G. Gamow). Rozlúštenie genetického kódu viedlo k početným teoretickým a experimentálnym štúdiám o štruktúre špirály DNA, mechanizme kĺzania a krútenia jej vlákien a štúdiu fyzikálnych síl zapojených do týchto procesov.

Molekulárna biofyzika poskytuje významnú pomoc molekulárnej biológii pri štúdiu štruktúry proteínových molekúl pomocou röntgenovej difrakčnej analýzy, ktorú prvýkrát použil v roku 1930 J. Bernal. V dôsledku použitia fyzikálnych metód v kombinácii s biochemickými (enzymatickými metódami) bola odhalená molekulárna konformácia a sekvencia aminokyselín v mnohých proteínoch.

Moderné štúdie elektrónovej mikroskopie, ktoré odhalili prítomnosť zložitých membránových systémov v bunkách a ich organelách, podnietili pokusy pochopiť ich molekulárnu štruktúru (pozri kapitoly 10 a 11). Študuje sa intravitálne chemické zloženie membrán a najmä vlastnosti ich lipidov. Zistilo sa, že tieto sú schopné peroxidácie a neenzymatických reťazových oxidačných reakcií (Yu. A. Vladimirov a F. F. Litvin, 1959; B. N. Tarusov a kol., 1960; I. I. Ivanov, 1967), čo vedie k narušeniu funkcií membrán. Na štúdium zloženia membrán sa použili aj metódy matematického modelovania (V. Ts. Presman, 1964 - 1968; M. M. Shemyakin, 1967; Yu. A. Ovchinnikov, 1972).

Bunková biofyzika

Významnou udalosťou v dejinách biofyziky bolo sformovanie jasných predstáv o termodynamike biologických procesov v 50. rokoch, v dôsledku čoho sa predpoklady o možnosti nezávislej tvorby energie v živých bunkách v rozpore s druhým termodynamickým zákonom, boli nakoniec zlikvidované. Pochopenie pôsobenia tohto zákona v biologických systémoch je spojené so zavedením belgického vedca I. Prigogina (1945) * do biologickej termodynamiky konceptu otvorených systémov vymieňajúcich si energiu a hmotu s vonkajším prostredím. Prigogine ukázal, že pozitívna entropia sa vytvára v živých bunkách počas pracovných procesov v súlade s druhým termodynamickým zákonom. Rovnice, ktoré zaviedol, určovali podmienky, za ktorých vzniká takzvaný stacionárny stav (predtým sa nazýval aj dynamická rovnováha), v ktorom množstvo voľnej energie (negentropia) vstupujúcej do buniek s potravou kompenzuje jej spotrebu a kladná entropia je odstránený. Tento objav posilnil všeobecnú biologickú predstavu o neoddeliteľnom spojení medzi vonkajším a vnútorným prostredím buniek. Položil základ pre skutočné štúdium termodynamiky živých systémov vrátane metódy modelovania (A. Burton, 1939; A. G. Pasynsky, 1967).

* (Všeobecnú teóriu otvorených systémov prvýkrát predložil L. Bertalanffy v roku 1932.)

Podľa základného princípu biotermodynamiky je nevyhnutnou podmienkou existencie života stacionárnosť vo vývoji jeho biochemických procesov, ktorých realizácia si vyžaduje koordináciu rýchlostí mnohých metabolických reakcií. Na základe novej biofyzikálnej termodynamiky sa objavil smer, ktorý identifikuje vonkajšie a vnútorné faktory, ktoré túto koordináciu reakcií zabezpečujú a robia ju stabilnou. Počas posledných dvoch desaťročí bola odhalená hlavná úloha pri udržiavaní stacionárneho stavu systému inhibítorov a najmä antioxidantov (B.N. Tarusov a A.I. Zhuravlev, 1954, 1958). Zistilo sa, že spoľahlivosť stacionárneho vývoja je spojená s faktormi prostredia (teplota) a fyzikálno-chemickými vlastnosťami bunkového prostredia.

Moderné princípy biotermodynamiky umožnili podať fyzikálnu a chemickú interpretáciu adaptačného mechanizmu. Podľa našich údajov k adaptácii na podmienky prostredia môže dôjsť len vtedy, ak pri ich zmene je organizmus schopný nastoliť stacionárnosť vo vývoji biochemických reakcií (B. N. Tarusov, 1974). Vznikla otázka o vývoji nových metód, ktoré by umožnili intravitálne posúdiť stacionárny stav a predpovedať jeho možné porušenia. Veľký prínos sľubuje zavedenie kybernetických princípov samoregulačných systémov do biotermodynamiky a výskum procesov biologickej adaptácie. Ukázalo sa, že na vyriešenie otázky stability ustáleného stavu je dôležité brať do úvahy takzvané rušivé faktory, medzi ktoré patria najmä neenzymatické reakcie oxidácie lipidov. V poslednej dobe sa stále viac rozširuje výskum procesov peroxidácie v lipidových fázach živých buniek a rastu produktov aktívnych radikálov, ktoré narúšajú regulačné funkcie membrán. Zdrojom informácií o týchto procesoch je detekcia aktívnych peroxidových radikálov a peroxidových zlúčenín biolipidov (A. Tappel, 1965; I. I. Ivanov, 1965; E. B. Burlakova, 1967 a i.). Na detekciu radikálov sa využíva biochemiluminiscencia, ktorá vzniká v lipidoch živých buniek pri ich rekombinácii.

Na základe fyzikálno-chemických predstáv o stabilite stacionárneho stavu vznikli biofyzikálne predstavy o adaptácii rastlín na zmeny podmienok prostredia ako porušenie inhibičných antioxidačných systémov (B. N. Tarusov, Ya. E. Doskoch, B. M. Kitlaev, A. M. Agaverdiev, 1968 - 1972). To otvorilo možnosť hodnotenia vlastností, ako je mrazuvzdornosť a tolerancia soli, ako aj vhodné predpovede pri šľachtení poľnohospodárskych rastlín.

V 50. rokoch bola objavená ultraslabá žiara - biochemoluminiscencia množstva biologických objektov vo viditeľnej a infračervenej časti spektra (B. N. Tarusov, A. I. Žuravlev, A. I. Polivoda). To sa stalo možným v dôsledku vývoja metód na zaznamenávanie ultraslabých svetelných tokov pomocou fotonásobičov (L. A. Kubetsky, 1934). Biochemiluminiscencia, ktorá je výsledkom biochemických reakcií prebiehajúcich v živej bunke, umožňuje posúdiť dôležité oxidačné procesy v reťazcoch prenosu elektrónov medzi enzýmami. Objav a štúdium biochemoluminiscencie má veľký teoretický a praktický význam. B. N. Tarusov a Yu. B. Kudryashov teda poznamenávajú veľkú úlohu oxidačných produktov nenasýtených mastných kyselín v mechanizme výskytu patologických stavov vyvíjajúcich sa pod vplyvom ionizujúceho žiarenia, počas karcinogenézy a iných porúch normálnych funkcií buniek.

V 50. rokoch v súvislosti s prudkým rozvojom jadrovej fyziky vznikla z biofyziky rádiobiológia, ktorá študuje biologické účinky ionizujúceho žiarenia. Výroba umelých rádioaktívnych izotopov, vytváranie termonukleárnych zbraní, jadrových reaktorov a vývoj ďalších foriem praktického využitia atómovej energie vyvolali akútny problém ochrany organizmov pred škodlivými účinkami ionizujúceho žiarenia, rozvíjali teoretické základy prevencie a liečba choroby z ožiarenia. Na to bolo potrebné v prvom rade zistiť, ktoré bunkové zložky a metabolické väzby sú najzraniteľnejšie.

Predmetom štúdia biofyziky a rádiobiológie bolo objasnenie podstaty primárnych chemických reakcií, ktoré sa vyskytujú v živých substrátoch pod vplyvom energie žiarenia. Tu bolo dôležité nielen porozumieť mechanizmom tohto javu, ale aj vedieť ovplyvniť proces výmeny fyzikálnej energie za chemickú a znížiť jeho koeficient „užitočného“ pôsobenia. Prácu v tomto smere inicioval výskum školy N. N. Semenova (1933) v ZSSR a D. Hinshelwooda (1935) v Anglicku.

Veľké miesto v rádiobiologickom výskume zaujalo štúdium stupňa odolnosti rôznych organizmov voči žiareniu. Zistilo sa, že zvýšená rádiorezistencia (napríklad púštne hlodavce) je spôsobená vysokou antioxidačnou aktivitou lipidov bunkových membrán (M. Chang a kol., 1964; N. K. Ogryzov a kol., 1969). Ukázalo sa, že tokoferoly, vitamín K a tio zlúčeniny hrajú dôležitú úlohu pri tvorbe antioxidačných vlastností týchto systémov (I. I. Ivanov et al., 1972). V posledných rokoch vzbudil veľkú pozornosť aj výskum mechanizmov mutagenézy. Za týmto účelom sa skúma vplyv ionizujúceho žiarenia na správanie nukleových kyselín a proteínov in vitro, ako aj vo vírusoch a fágoch (A. Gustafson, 1945 - 1950).

Hlavnými úlohami biofyziky v tomto smere zostáva boj o ďalšie zvyšovanie účinnosti chemickej ochrany, hľadanie účinnejších inhibítorov a princípov inhibície.

Štúdium excitovaných stavov biopolymérov, ktoré určujú ich vysokú chemickú aktivitu, pokročilo. Najúspešnejšie štúdie sa uskutočnili na excitovaných stavoch, ktoré vznikajú v primárnom štádiu fotobiologických procesov - fotosyntéza a videnie.

Bol teda urobený solídny príspevok k pochopeniu primárnej aktivácie molekúl rastlinných pigmentových systémov. Zistil sa veľký význam prenosu (migrácie) energie excitovaných stavov bez straty z aktivovaných pigmentov na iné substráty. Veľkú úlohu v rozvoji týchto myšlienok zohrali teoretické práce A. N. Terenina (1947 a neskôr). A. A. Krasnovsky (1949) objavil a študoval reakciu reverzibilnej fotochemickej redukcie chlorofylu a jeho analógov. Teraz panuje všeobecné presvedčenie, že v blízkej budúcnosti bude možné reprodukovať fotosyntézu v umelých podmienkach (pozri tiež kapitolu 5).

Biofyzici pokračujú v práci na odhalení povahy svalovej kontrakcie a mechanizmov nervovej excitácie a vedenia (pozri kapitolu 11). Súčasný význam nadobudol aj výskum mechanizmov prechodu z excitovaného stavu do normálneho stavu. Excitovaný stav sa teraz považuje za výsledok autokatalytickej reakcie a inhibícia za dôsledok prudkej mobilizácie inhibičnej antioxidačnej aktivity v dôsledku molekulárnych preskupení v zlúčeninách, ako je tokoferol (I. I. Ivanov, O. R. Kols, 1966; O. R. Kols, 1970).

Najdôležitejším všeobecným problémom biofyziky zostáva poznanie kvalitatívnych fyzikálnych a chemických charakteristík živej hmoty. Vlastnosti ako schopnosť živých biopolymérov selektívne viazať draslík či polarizovať elektrický prúd sa nedajú zachovať ani pri najopatrnejšom odstránení z tela. Preto bunková biofyzika naďalej intenzívne rozvíja kritériá a metódy pre intravitálny výskum živej hmoty.

Napriek mladosti v molekulárnej biológii sú úspechy dosiahnuté v tejto oblasti skutočne ohromujúce. V relatívne krátkom čase bola stanovená povaha génu a základné princípy jeho organizácie, reprodukcie a fungovania. Okrem toho sa uskutočnila nielen propagácia génov in vitro, ale po prvýkrát bola dokončená aj úplná syntéza samotného génu. Genetický kód bol úplne dešifrovaný a najdôležitejší biologický problém špecifickosti biosyntézy proteínov bol vyriešený. Boli identifikované a študované hlavné dráhy a mechanizmy tvorby proteínov v bunke. Primárna štruktúra mnohých transportných RNA - špecifických adaptorových molekúl, ktoré prekladajú reč nukleových matríc do reči aminokyselinovej sekvencie syntetizovaného proteínu - bola úplne určená. Aminokyselinová sekvencia mnohých proteínov bola úplne dešifrovaná a priestorová štruktúra niektorých z nich bola stanovená. To umožnilo objasniť princíp a detaily fungovania molekúl enzýmov. Uskutočnila sa chemická syntéza jedného z enzýmov, ribonukleázy. Boli stanovené základné princípy organizácie rôznych subcelulárnych častíc, mnohých vírusov a fágov a boli odhalené hlavné cesty ich biogenézy v bunke. Boli odhalené prístupy k pochopeniu spôsobov regulácie génovej aktivity a objasnenia regulačných mechanizmov života. Už jednoduchý zoznam týchto objavov naznačuje, že druhá polovica 20. stor. bola poznačená obrovským pokrokom v biológii, za čo vďačí predovšetkým hĺbkovému štúdiu štruktúry a funkcií biologicky dôležitých makromolekúl – nukleových kyselín a bielkovín.

Výdobytky molekulárnej biológie sa už využívajú v praxi a prinášajú hmatateľné výsledky v medicíne, poľnohospodárstve a niektorých odvetviach. Niet pochýb o tom, že vplyv tejto vedy sa bude každým dňom zvyšovať. Za hlavný výsledok však stále treba považovať, že pod vplyvom úspechov molekulárnej biológie sa posilnila dôvera v existenciu neobmedzených možností na ceste k odhaľovaniu najintímnejších tajomstiev života.

V budúcnosti sa zrejme otvoria nové cesty na štúdium biologickej formy pohybu hmoty – z molekulárnej úrovne sa biológia presunie na atómovú úroveň. Teraz však snáď neexistuje jediný výskumník, ktorý by dokázal reálne predpovedať vývoj molekulárnej biológie aj na najbližších 20 rokov.

Na now.nsexy.ru/ zažijete nezabudnuteľný čas.