Najdôležitejšie metódy molekulárnej biológie a genetického inžinierstva. Molekulárny biológ

Rozvoj biochémie, biofyziky, genetiky, cytochémie, mnohých sekcií mikrobiológie a virológie okolo začiatku 40-tych rokov XX storočia. úzko viedli k štúdiu životných javov na molekulárnej úrovni. Úspechy dosiahnuté týmito vedami súčasne a z rôznych strán viedli k poznaniu skutočnosti, že na molekulárnej úrovni fungujú hlavné riadiace systémy tela a že ďalší pokrok týchto vied bude závisieť od odhalenia biologické funkcie molekúl, ktoré tvoria telá organizmov, ich účasť na syntéze a dezintegrácii, vzájomných premenách a reprodukcii zlúčenín v bunke, ako aj výmena energie a informácií, ku ktorej v tomto prípade dochádza. Na styku týchto biologických disciplín s chémiou a fyzikou tak vznikol úplne nový odbor – molekulárna biológia.

Na rozdiel od biochémie sa pozornosť modernej molekulárnej biológie sústreďuje najmä na štúdium štruktúry a funkcie najdôležitejších tried biopolymérov - proteínov a nukleových kyselín, z ktorých prvé určujú samotnú možnosť metabolických reakcií a druhé - tzv. biosyntéza špecifických proteínov. Je teda jasné, že nie je možné jasne rozlišovať medzi molekulárnou biológiou a biochémiou, zodpovedajúcimi odvetviami genetiky, mikrobiológie a virológie.

Vznik molekulárnej biológie bol úzko spojený s vývojom nových výskumných metód, o ktorých už bola reč v príslušných kapitolách. Spolu s rozvojom elektrónovej mikroskopie a iných metód mikroskopickej techniky zohrali významnú úlohu metódy frakcionácie bunkových elementov vyvinuté v 50. rokoch 20. storočia. Boli založené na zdokonalených metódach diferenciálnej centrifugácie (A. Claude, 1954). V tom čase už existovali celkom spoľahlivé metódy na izoláciu a frakcionáciu biopolymérov. Patrí sem najmä metóda frakcionácie proteínov elektroforézou navrhnutá A. Tiseliusom (1937; Nobelova cena, 1948), metódy izolácie a čistenia nukleových kyselín (E. Kay, A. Downs, M. Sevag, A. Mirsky a ďalšie.). Zároveň boli v mnohých svetových laboratóriách vyvinuté rôzne metódy chromatografickej analýzy (A. Martin a R. Sing, 1941; Nobelova cena, 1952), následne výrazne zdokonalené.

Röntgenová difrakčná analýza zohrala neoceniteľnú službu pri dešifrovaní štruktúry biopolymérov. Základné princípy röntgenovej difrakčnej analýzy boli vyvinuté na King's College London University pod vedením W. Bragga skupinou výskumníkov, ku ktorým patrili J. Bernal, A. Londsdale, W. Astbury, J. Robertson a ďalší.

Osobitne treba spomenúť štúdie biochémie protoplazmy (1925 - 1929), profesora Moskovskej štátnej univerzity A. R. Kizela, ktoré mali veľký význam pre ďalší rozvoj molekulárnej biológie. Kizel zasadil ranu pevne zakorenenej predstave, že každá protoplazma je založená na špeciálnom proteínovom tele – doštičkách, ktoré údajne určuje všetky jej najdôležitejšie štrukturálne a funkčné znaky. Ukázal, že doštičky sú proteín, ktorý sa nachádza iba v myxomycétach a potom v určitom štádiu vývoja a že v protoplazme neexistuje žiadna trvalá zložka - jediný kostrový proteín. Štúdium problému štruktúry protoplazmy a funkčnej úlohy proteínov sa teda uberalo správnou cestou a dostalo priestor pre svoj rozvoj. Kiselov výskum získal celosvetové uznanie a stimuloval štúdium chémie základných častí bunky.

Pojem „molekulárna biológia“, ktorý prvýkrát použil anglický kryštalograf profesor Leedsskej univerzity W. Astbury, sa pravdepodobne objavil začiatkom 40. rokov 20. storočia (pred rokom 1945). Základné röntgenové difrakčné štúdie proteínov a DNA, ktoré vykonal Astbury v 30. rokoch 20. storočia, slúžili ako základ pre následné úspešné rozlúštenie sekundárnej štruktúry týchto biopolymérov. V roku 1963 J. Bernal napísal: „Pomník mu postaví celá molekulárna biológia – veda, ktorú pomenoval a skutočne založil“ * , V literatúre sa tento termín prvýkrát objavil snáď v roku 1946 v článku W. Astburyho „Progress of X-ray difraction analysis of organic and fibrillar materials“, publikovanom v anglickom časopise „Nature“**. Astbury (1950) vo svojej Harvey Lecture poznamenal: "Som rád, že termín molekulárna biológia je teraz pomerne široko používaný, aj keď je nepravdepodobné, že by som ho navrhol ja ako prvý. Páčilo sa mi to a dlho som sa ho snažil šíriť." “***. Už v roku 1950 bolo Astbury jasné, že molekulárna biológia sa zaoberá predovšetkým štruktúrou a konformáciou makromolekúl, ktorých štúdium má rozhodujúci význam pre pochopenie fungovania živých organizmov.

* (biogr. Mem. Kolegovia Roy. Soc, 1963, v. 9, 29.)

** (W. T. Astbury. Pokrok v röntgenovej analýze organických a vláknitých štruktúr.- Príroda,. 1946, v. 157, 121.)

*** (W. T. Astbury. Dobrodružstvá v molekulárnej biológii. Thomas Springfield, 1952, s. 3.)

Molekulárna biológia čelila a čelí v podstate tým istým úlohám ako biológia ako celok – poznanie podstaty života a jeho základných javov, najmä dedičnosti a premenlivosti. Moderná molekulárna biológia má predovšetkým dešifrovať štruktúru a funkciu génov, spôsoby a mechanizmy realizácie genetickej informácie organizmov v rôznych štádiách ontogenézy a v rôznych štádiách jej čítania. Je navrhnutý tak, aby odhalil jemné mechanizmy regulácie génovej aktivity a diferenciácie buniek, objasnil podstatu mutagenézy a molekulárny základ evolučného procesu.

Stanovenie genetickej úlohy nukleových kyselín

Pre rozvoj molekulárnej biológie mali najväčší význam nasledujúce objavy. V roku 1944 americkí výskumníci O. Avery, K. McLeod (Nobelova cena, 1923) a M. McCarthy ukázali, že molekuly DNA izolované z pneumokokov majú transformačnú aktivitu. Po hydrolýze týchto DNA deoxyribonukleázou ich transformačná aktivita úplne vymizla. Prvýkrát sa tak presvedčivo dokázalo, že genetické funkcie v bunke má DNA, a nie proteín.

Pre spravodlivosť treba poznamenať, že fenomén bakteriálnej transformácie bol objavený oveľa skôr ako objav Averyho, McLeoda a McCarthyho. V roku 1928 F. Griffith publikoval článok, v ktorom uvádza, že po pridaní usmrtených buniek enkapsulovaného virulentného kmeňa k nevirulentným (nezapuzdreným) pneumokokom sa výsledná zmes buniek stáva pre myši osudnou. Navyše živé pneumokokové bunky izolované zo zvierat infikovaných touto zmesou už boli virulentné a mali polysacharidovú kapsulu. V tomto experimente sa teda ukázalo, že vplyvom niektorých zložiek usmrtených pneumokokových buniek sa neopuzdrená forma baktérií mení na virulentnú formu tvoriacu kapsuly. O šestnásť rokov neskôr Avery, McLeod a McCarthy v tomto experimente nahradili usmrtené celé pneumokokové bunky ich deoxyribonukleovou kyselinou a ukázali, že to bola DNA, ktorá mala transformačnú aktivitu (pozri tiež kapitoly 7 a 25). Význam tohto objavu je ťažké preceňovať. Podnietilo to štúdium nukleových kyselín v mnohých laboratóriách po celom svete a prinútilo vedcov zamerať sa na DNA.

Spolu s objavom Averyho, McLeoda a McCarthyho sa začiatkom 50. rokov nazhromaždilo pomerne veľké množstvo priamych a nepriamych dôkazov o tom, že nukleové kyseliny hrajú v živote výnimočnú úlohu a nesú genetickú funkciu. Naznačoval to najmä charakter lokalizácie DNA v bunke a údaje R. Vendrelliho (1948), že obsah DNA na bunku je prísne konštantný a koreluje so stupňom ploidie: v haploidných zárodočných bunkách je DNA polovicu v porovnaní s diploidnými somatickými bunkami. Výrazná metabolická stabilita DNA tiež svedčila v prospech genetickej úlohy DNA. Začiatkom 50. rokov sa nahromadilo množstvo rôznych faktov, ktoré naznačujú, že väčšina známych mutagénnych faktorov pôsobí hlavne na nukleové kyseliny a najmä na DNA (R. Hotchkiss, 1949; G. Ephrussi-Taylor, 1951; E. Freese, 1957 a ďalšie).

Osobitný význam pri stanovení genetickej úlohy nukleových kyselín malo štúdium rôznych fágov a vírusov. V roku 1933 našiel D. Schlesinger DNA v bakteriofágu Escherichia coli. Od izolácie vírusu tabakovej mozaiky (TMV) v kryštalickom stave W. Stanleym (1935, Nobelova cena, 1946) sa začala nová etapa v štúdiu rastlinných vírusov. V rokoch 1937-1938. pracovníci poľnohospodárskej stanice Rothamsted (Anglicko) F. Bowden a N. Peary ukázali, že mnohé nimi izolované rastlinné vírusy nie sú globulíny, ale sú to ribonukleoproteíny a ako povinnú zložku obsahujú nukleovú kyselinu. Na samom začiatku 40. rokov boli publikované práce G. Schramma (1940), P. A. Agatova (1941), G. Millera a W. Stanleyho (1941), ktoré naznačujú, že výrazná chemická modifikácia bielkovinovej zložky nevedie k strate infekčnosti TMV. To naznačovalo, že proteínová zložka nemôže byť nositeľom dedičných vlastností vírusu, ako sa mnohí mikrobiológovia naďalej domnievali. Presvedčivé dôkazy v prospech genetickej úlohy nukleovej kyseliny (RNA) v rastlinných vírusoch získali v roku 1956 G. Schramm v Tübingene (SRN) a H. Frenkel-Konrath v Kalifornii (USA). Títo výskumníci takmer súčasne a nezávisle od seba izolovali RNA z TMV a ukázali, že ona, a nie proteín, má infekčnosť: v dôsledku infekcie tabakových rastlín touto RNA sa v nich vytvorili a rozmnožili normálne vírusové častice. To znamenalo, že RNA obsahovala informácie pre syntézu a zostavenie všetkých vírusových zložiek, vrátane vírusového proteínu. V roku 1968 I. G. Atabekov zistil, že proteín hrá významnú úlohu pri samotnej infekcii rastlín – povaha proteínu určuje spektrum hostiteľských rastlín.

V roku 1957 Frenkel-Konrat prvýkrát vykonal rekonštrukciu TMV z jeho základných zložiek - RNA a proteínu. Spolu s normálnymi časticami dostal zmiešané „hybridy“, v ktorých bola RNA z jedného kmeňa a proteín z druhého. Dedičnosť takýchto hybridov bola úplne určená RNA a potomstvo vírusov patrilo kmeňu, ktorého RNA bola použitá na získanie počiatočných zmiešaných častíc. Neskôr experimenty A. Gierera, G. Schustera a G. Schramma (1958) a G. Witmana (1960 - 1966) ukázali, že chemická modifikácia jadrovej zložky TMV vedie k objaveniu sa rôznych mutantov tohto vírusu.

V roku 1970 D. Baltimore a G. Temin zistili, že prenos genetickej informácie môže nastať nielen z DNA do RNA, ale aj naopak. V niektorých onkogénnych vírusoch obsahujúcich RNA (onkornavírusy) našli špeciálny enzým, takzvanú reverznú transkriptázu, ktorá je schopná syntetizovať komplementárnu DNA na reťazcoch RNA. Tento významný objav umožnil pochopiť mechanizmus inzercie genetickej informácie vírusov obsahujúcich RNA do hostiteľského genómu a nový pohľad na povahu ich onkogénneho účinku.

Objav nukleových kyselín a štúdium ich vlastností

Termín nukleové kyseliny zaviedol nemecký biochemik R. Altman v roku 1889 po tom, čo tieto zlúčeniny v roku 1869 objavil švajčiarsky lekár F. Miescher. Misher extrahoval bunky hnisu zriedenou kyselinou chlorovodíkovou niekoľko týždňov a vo zvyšku získal takmer čistý jadrový materiál. Tento materiál považoval za charakteristickú "látku bunkových jadier a nazval ho nukleín. Svojimi vlastnosťami sa nukleín výrazne líšil od bielkovín: bol kyslejší, neobsahoval síru, ale obsahoval veľa fosforu, bol ľahko rozpustný v zásadách, ale nerozpúšťal sa v zriedených kyselinách.

Misher poslal výsledky svojich pozorovaní o nukleíne F. Goppe-Seylerovi na publikovanie v časopise. Látka, ktorú opísal, bola taká nezvyčajná (v tom čase bol zo všetkých biologických zlúčenín obsahujúcich fosfor známy len lecitín), že Goppe-Seyler Misherovým experimentom neveril, rukopis mu vrátil a dal pokyn svojim zamestnancom N. Ploshovi a N. Lyubavinovi, aby skontrolujte jeho závery na inom materiáli. Miescherova práca „O chemickom zložení buniek hnisu“ vyšla o dva roky neskôr (1871). Súčasne boli publikované práce Goppe-Seylera a jeho spolupracovníkov o zložení buniek hnisu, erytrocytov vtákov, hadov a iných buniek. Počas nasledujúcich troch rokov bol nukleín izolovaný zo živočíšnych buniek a kvasiniek.

Misher vo svojej práci poznamenal, že podrobné štúdium rôznych nukleínov môže viesť k zisteniu rozdielov medzi nimi, čím sa predvída myšlienka špecifickosti nukleových kyselín. Misher pri štúdiu lososového mlieka zistil, že nukleín v nich je vo forme soli a je spojený s hlavným proteínom, ktorý nazval protamín.

V roku 1879 začal A. Kossel študovať nukleíny v laboratóriu Goppe-Seyler. V roku 1881 izoloval hypoxantín z nukleínu, no vtedy ešte pochyboval o pôvode tejto bázy a veril, že hypoxantín môže byť degradačným produktom bielkovín. V roku 1891 objavil Kossel medzi produktmi hydrolýzy nukleínu adenín, guanín, kyselinu fosforečnú a ďalšiu látku s vlastnosťami cukru. Za výskum chémie nukleových kyselín získal Kossel v roku 1910 Nobelovu cenu.

Ďalší pokrok v dešifrovaní štruktúry nukleových kyselín je spojený s výskumom P. Levina a kolektívu (1911 - 1934). V roku 1911 P. Levin a V. Jacobs identifikovali sacharidovú zložku adenozínu a guanozínu; zistili, že tieto nukleozidy obsahujú D-ribózu. V roku 1930 Lewin ukázal, že sacharidová zložka deoxyribonukleozidov je 2-deoxy-D-ribóza. Z jeho práce sa stalo známe, že nukleové kyseliny sú postavené z nukleotidov, t.j. fosforylovaných nukleozidov. Levin veril, že hlavným typom väzby v nukleových kyselinách (RNA) je 2", 5" fosfodiesterová väzba. Táto predstava sa ukázala ako nesprávna. Vďaka práci anglického chemika A. Todda (Nobelova cena, 1957) a jeho spolupracovníkov, ako aj anglických biochemikov R. Markhama a J. Smitha sa začiatkom 50. rokov preslávilo, že hlavným typom väzby v RNA je 3", 5" - fosfodiesterová väzba.

Lewin ukázal, že rôzne nukleové kyseliny sa môžu líšiť v povahe sacharidovej zložky: niektoré z nich obsahujú cukor deoxyribózu, zatiaľ čo iné obsahujú ribózu. Okrem toho sa tieto dva typy nukleových kyselín líšili povahou jednej zo zásad: nukleové kyseliny pentózového typu obsahovali uracil a nukleové kyseliny deoxypentózového typu obsahovali tymín. Nukleová kyselina deoxypentózová (v modernej terminológii kyselina deoxyribonukleová - DNA) sa zvyčajne ľahko izolovala vo veľkých množstvách z týmusu (sladkej žľazy) teliat. Preto sa nazývala tymonukleová kyselina. Zdrojom nukleovej kyseliny pentózového typu (RNA) boli najmä kvasinky a pšeničné klíčky. Tento typ bol často označovaný ako kvasinková nukleová kyselina.

Začiatkom 30-tych rokov 20. storočia bol skôr pevne zakorenený názor, že rastlinné bunky sú charakterizované nukleovou kyselinou kvasinkového typu, kým tymonukleová kyselina je charakteristická len pre jadrá živočíšnych buniek. Dva typy nukleových kyselín, RNA a DNA, sa potom nazývali rastlinné a živočíšne nukleové kyseliny. Ako však ukázali rané štúdie A. N. Belozerského, takéto delenie nukleových kyselín je neopodstatnené. V roku 1934 Belozersky prvýkrát objavil tymonukleovú kyselinu v rastlinných bunkách: zo sadeníc hrachu izoloval a identifikoval tymín-pyrimidínovú bázu, ktorá je charakteristická pre DNA. Potom objavil tymín v iných rastlinách (sójové semená, fazuľa). V roku 1936 A. N. Belozersky a I. I. Dubrovskaya preparatívne izolovali DNA zo sadeníc pagaštanu konského. Okrem toho séria štúdií vykonaných v Anglicku v 40. rokoch 20. storočia D. Davidsonom a spolupracovníkmi presvedčivo ukázala, že rastlinná nukleová kyselina (RNA) je obsiahnutá v mnohých živočíšnych bunkách.

Široké využitie cytochemickej reakcie pre DNA vyvinutú R. Felgenom a G. Rosenbeckom (1924) a reakcie J. Bracheta (1944) pre RNA umožnili rýchlo a jednoznačne vyriešiť otázku preferenčnej lokalizácie týchto nukleových kyseliny v bunke. Ukázalo sa, že DNA je koncentrovaná v jadre, zatiaľ čo RNA je prevažne koncentrovaná v cytoplazme. Neskôr sa zistilo, že RNA je obsiahnutá aj v cytoplazme aj v jadre a navyše bola identifikovaná cytoplazmatická DNA.

Pokiaľ ide o otázku primárnej štruktúry nukleových kyselín, do polovice 40. rokov 20. storočia sa vo vede pevne etablovala myšlienka P. Levina, podľa ktorej sú všetky nukleové kyseliny postavené podľa rovnakého typu a pozostávajú z rovnakého tzv. bloky. Každý z týchto blokov podľa Lewina obsahuje štyri rôzne nukleotidy. Tetranukleotidová teória štruktúry nukleových kyselín do značnej miery pripravila tieto biopolyméry o špecifickosť. Preto nie je prekvapujúce, že v tom čase boli všetky špecifiká živých vecí spojené iba s proteínmi, ktorých povaha monomérov je oveľa rozmanitejšia (20 aminokyselín).

Prvú medzeru v teórii tetranukleotidovej štruktúry nukleových kyselín vytvorili analytické údaje anglického chemika J. Goulanda (1945 - 1947). Pri určovaní zloženia nukleových kyselín bázickým dusíkom nezískal ekvimolárny pomer báz, ako by mal byť podľa Lewinovej teórie. Tetranukleotidová teória štruktúry nukleových kyselín napokon stroskotala v dôsledku výskumu E. Chargaffa a jeho spolupracovníkov (1949 - 1951). Chargaff použil papierovú chromatografiu na oddelenie báz uvoľnených z DNA v dôsledku jej kyslej hydrolýzy. Každá z týchto báz bola presne stanovená spektrofotometricky. Chargaff si všimol významné odchýlky od ekvimolárneho pomeru báz v DNA rôzneho pôvodu a po prvýkrát definitívne uviedol, že DNA má výraznú druhovú špecifickosť. Tým sa skončila hegemónia konceptu proteínovej špecifickosti v živej bunke. Analýzou DNA rôzneho pôvodu Chargaff objavil a sformuloval jedinečné vzorce zloženia DNA, ktoré vstúpili do vedy pod názvom Chargaffove pravidlá. Podľa týchto pravidiel sa vo všetkých DNA bez ohľadu na pôvod množstvo adenínu rovná množstvu tymínu (A = T), množstvo guanínu sa rovná množstvu cytozínu (G = C), množstvo purínov sa rovná množstvu pyrimidínov (G + A = C + T), množstvo báz so 6-aminoskupinami sa rovná počtu báz so 6-ketoskupinami (A + C = G + T). Zároveň, napriek takýmto prísnym kvantitatívnym zhodám, sa DNA rôznych druhov líšia v hodnote pomeru A+T:G+C. V niektorých DNA prevažuje množstvo guanínu a cytozínu nad množstvom adenínu a tymínu (Chargaff nazval tieto DNA DNA typu GC); iné DNA obsahovali viac adenínu a tymínu ako guanín a cytozín (tieto DNA sa nazývali DNA typu AT). Údaje, ktoré získal Chargaff o zložení DNA, zohrali v molekulárnej biológii výnimočnú úlohu. Práve tie tvorili základ pre objav štruktúry DNA, ktorý v roku 1953 urobili J. Watson a F. Crick.

V roku 1938 W. Astbury a F. Bell pomocou röntgenovej difrakčnej analýzy ukázali, že základné roviny v DNA by mali byť kolmé na dlhú os molekuly a pripomínať, ako to bolo, hromadu dosiek ležiacich na vrchu. navzájom. So zlepšením techniky röntgenovej difrakčnej analýzy v rokoch 1952 - 1953. nahromadené informácie, ktoré umožnili posúdiť dĺžku jednotlivých väzieb a uhly sklonu. To umožnilo s najväčšou pravdepodobnosťou znázorniť povahu orientácie kruhov pentózových zvyškov v sacharidovo-fosfátovom hlavnom reťazci molekuly DNA. V roku 1952 S. Farberg navrhol dva špekulatívne modely DNA, ktoré predstavovali jednovláknovú molekulu zloženú alebo skrútenú na sebe. Nemenej špekulatívny model štruktúry DNA navrhli v roku 1953 L. Pauling (nositeľ Nobelovej ceny, 1954) a R. Corey. V tomto modeli tri skrútené vlákna DNA vytvorili dlhú špirálu, ktorej jadro predstavovali fosfátové skupiny a bázy sa nachádzali mimo nej. V roku 1953 M. Wilkins a R. Franklin získali jasnejšie röntgenové difrakčné obrazce DNA. Ich analýza ukázala úplné zlyhanie modelov Farberga, Paulinga a Coreyho. Pomocou Chargaffových údajov, porovnávaním rôznych kombinácií molekulárnych modelov jednotlivých monomérov a údajov röntgenovej difrakcie, J. Watson a F. Crick v roku 1953 dospeli k záveru, že molekula DNA musí byť dvojvláknová špirála. Chargaffove pravidlá výrazne obmedzili počet možných usporiadaných kombinácií báz v navrhovanom modeli DNA; navrhli Watsonovi a Crickovi, že v molekule DNA musí existovať špecifické párovanie báz - adenín s tymínom a guanín s cytozínom. Inými slovami, adenín v jednom vlákne DNA vždy presne zodpovedá tymínu v druhom vlákne a guanín v jednom vlákne nevyhnutne zodpovedá cytozínu v druhom vlákne. Watson a Crick teda ako prví sformulovali mimoriadne dôležitý princíp komplementárnej štruktúry DNA, podľa ktorého jedno vlákno DNA dopĺňa iné, t.j. sekvencia báz jedného vlákna jednoznačne určuje sekvenciu báz v druhom (komplementárnom) vlákne. . Ukázalo sa, že už v samotnej štruktúre DNA sa skrýva potenciál na jej presnú reprodukciu. Tento model štruktúry DNA je v súčasnosti všeobecne akceptovaný. Crick, Watson a Wilkins dostali v roku 1962 Nobelovu cenu za rozlúštenie štruktúry DNA.

Treba poznamenať, že myšlienka mechanizmu na presnú reprodukciu makromolekúl a prenos dedičných informácií vznikla u nás. V roku 1927 N. K. Koltsov navrhol, že počas reprodukcie buniek dochádza k reprodukcii molekúl presnou autokatalytickou reprodukciou existujúcich rodičovských molekúl. Je pravda, že v tom čase Koltsov obdaril túto vlastnosť nie molekulami DNA, ale molekulami proteínovej povahy, ktorých funkčný význam bol vtedy neznámy. Samotná myšlienka autokatalytickej reprodukcie makromolekúl a mechanizmus prenosu dedičných vlastností sa však ukázal ako prorocký: stal sa hlavnou myšlienkou modernej molekulárnej biológie.

Vedené v laboratóriu A. N. Belozerského A. S. Spirinom, G. N. Zaitsevom, B. F. Vanyushinom, S. O. Urysonom, A. S. Antonovom a ďalšími rôznymi organizmami plne potvrdili vzory objavené Chargaffom a úplnú zhodu s molekulárnym modelom štruktúry DNA, ktorý navrhol Watson. a Crick. Tieto štúdie ukázali, že DNA rôznych baktérií, húb, rias, aktinomycét, vyšších rastlín, bezstavovcov a stavovcov má špecifické zloženie. Rozdiely v zložení (obsah párov AT-báz) sú obzvlášť výrazné u mikroorganizmov, čo sa ukázalo byť dôležitým taxonomickým znakom. U vyšších rastlín a živočíchov sú druhové variácie v zložení DNA oveľa menej výrazné. To však neznamená, že ich DNA je menej špecifická. Okrem zloženia báz je špecifickosť do značnej miery určená ich sekvenciou v reťazcoch DNA.

Spolu s obvyklými bázami sa v DNA a RNA našli ďalšie dusíkaté bázy. G. White (1950) teda našiel 5-metylcytozín v DNA rastlín a živočíchov a D. Dunn a J. Smith (1958) našli v niektorých DNA metylovaný adenín. Po dlhú dobu bol metylcytozín považovaný za charakteristický znak genetického materiálu vyšších organizmov. V roku 1968 A. N. Belozersky, B. F. Vanyushin a N. A. Kokurina zistili, že ho možno nájsť aj v DNA baktérií.

V roku 1964 M. Gold a J. Hurwitz objavili novú triedu enzýmov, ktoré vykonávajú prirodzenú modifikáciu DNA – jej metyláciu. Po tomto objave sa ukázalo, že minoritné (obsiahnuté v malých množstvách) bázy vznikajú už na hotovom polynukleotidovom reťazci DNA ako výsledok špecifickej metylácie cytozínových a adenínových zvyškov v špeciálnych sekvenciách. Najmä podľa B. F. Vanyushina, Ya. I. Buryanova a A. N. Belozerského (1969) sa metylácia adenínu v DNA E. coli môže vyskytnúť v koncových kodónoch. Podľa A. N. Belozerského a kolegov (1968 - 1970), ako aj M. Meselsona (USA) a V. Arbera (Švajčiarsko) (1965 - 1969) dáva metylácia molekulám DNA jedinečné individuálne vlastnosti a v kombinácii s pôsobením špecifických nukleáz, je súčasťou komplexného mechanizmu, ktorý riadi syntézu DNA v bunke. Inými slovami, povaha metylácie konkrétnej DNA predurčuje otázku, či sa môže v danej bunke množiť.

Takmer v rovnakom čase začala izolácia a intenzívne štúdium DNA metyláz a reštrikčných endonukleáz; v rokoch 1969-1975 boli stanovené nukleotidové sekvencie rozpoznávané v DNA niektorými z týchto enzýmov (X. Boyer, X. Smith, S. Lynn, K. Murray). Keď sú rôzne DNA hydrolyzované reštrikčným enzýmom, odštiepia sa pomerne veľké fragmenty s identickými "lepivými" koncami. To umožňuje nielen analyzovať štruktúru génov, ako sa to robí u malých vírusov (D. Nathans, S. Adler, 1973 - 1975), ale aj konštruovať rôzne genómy. S objavom týchto špecifických reštrikčných enzýmov sa genetické inžinierstvo stalo hmatateľnou realitou. Gény rôzneho pôvodu vložené do malých plazmidových DNA sa už ľahko zavádzajú do rôznych buniek. Tak sa získal nový typ biologicky aktívnych plazmidov, poskytujúcich rezistenciu voči určitým antibiotikám (S. Cohen, 1973), ribozomálne gény žaby a Drosophila boli zavedené do plazmidov Escherichia coli (J. Morrow, 1974; X. Boyer, D. Hogness, R. Davis, 1974 - 1975). Otvárajú sa teda skutočné cesty na získanie zásadne nových organizmov zavedením a integráciou rôznych génov do ich genofondu. Tento objav môže byť nasmerovaný v prospech celého ľudstva.

V roku 1952 G. White a S. Cohen zistili, že DNA fágov T-párnych obsahuje nezvyčajnú bázu – 5-hydroxymetylcytozín. Neskôr z prác E. Volkina a R. Sinsheimera (1954) a Cohena (1956) sa zistilo, že hydroxymetylcytozínové zvyšky môžu byť úplne alebo čiastočne glukozidizované, v dôsledku čoho je molekula fágovej DNA chránená pred hydrolytickým účinkom. nukleáz.

Začiatkom 50. rokov 20. storočia z prác D. Dunna a J. Smitha (Anglicko), S. Zamenhofa (USA) a A. Wackera (Nemecko) sa zistilo, že do DNA možno zahrnúť mnohé analógy umelých báz, ktoré niekedy nahrádzajú až 50% tymínu. Tieto substitúcie spravidla vedú k chybám v replikácii, transkripcii a translácii DNA a k výskytu mutantov. J. Marmur (1962) teda zistil, že DNA niektorých fágov obsahuje namiesto tymínu oxymetyluracil. V roku 1963 I. Takahashi a J. Marmur zistili, že DNA jedného z fágov obsahuje uracil namiesto tymínu. Zrútil sa tak ďalší princíp, podľa ktorého sa predtým separovali nukleové kyseliny. Od čias práce P. Levina sa verilo, že tymín je charakteristickým znakom DNA a uracil je charakteristickým znakom RNA. Ukázalo sa, že tento znak nie je vždy spoľahlivý a zásadný rozdiel v chemickej povahe dvoch typov nukleových kyselín, ako sa dnes zdá, je iba povaha sacharidovej zložky.

Pri štúdiu fágov bolo odhalených mnoho nezvyčajných znakov organizácie nukleových kyselín. Od roku 1953 sa verilo, že všetka DNA sú dvojvláknové lineárne molekuly, zatiaľ čo RNA je len jednovláknová. Táto pozícia bola výrazne otrasená v roku 1961, keď R. Sinsheimer zistil, že DNA fága φ X 174 je reprezentovaná jednovláknovou kruhovou molekulou. Neskôr sa však ukázalo, že v tejto forme táto DNA existuje len vo vegetatívnej fágovej častici a replikatívna forma DNA tohto fága je tiež dvojvláknová. Navyše sa celkom neočakávane ukázalo, že RNA niektorých vírusov môže byť dvojvláknová. Tento nový typ makromolekulovej organizácie RNA objavili v roku 1962 P. Gomatos, I. Tamm a ďalší výskumníci v niektorých živočíšnych vírusoch a vo víruse nádorových rán rastlín. Nedávno V. I. Agol a A. A. Bogdanov (1970) zistili, že okrem lineárnych molekúl RNA existujú aj uzavreté alebo cyklické molekuly. Detegovali cyklickú dvojvláknovú RNA najmä vo víruse encefalomyelokarditídy. Vďaka prácam X. Deveauxa, L. Tinoka, T. I. Tikhonenka, E. I. Budovského a iných (1960 - 1974) sa stali známymi hlavné črty organizácie (ukladanie) genetického materiálu v bakteriofágoch.

Koncom 50. rokov minulého storočia americký vedec P. Doty zistil, že zahrievanie spôsobuje denaturáciu DNA, ktorá je sprevádzaná rozpadom vodíkových väzieb medzi pármi báz a oddelením komplementárnych reťazcov. Tento proces má charakter fázového prechodu „spiral-coil“ a pripomína topenie kryštálov. Doty preto nazval proces tepelnej denaturácie DNA tavením DNA. Pri pomalom ochladzovaní dochádza k renaturácii molekúl, teda k opätovnému zjednoteniu komplementárnych polovíc.

Princíp renaturácie v roku 1960 použili J. Marmur a K. Schildkraut na určenie stupňa „hybridizovateľnosti“ DNA rôznych mikroorganizmov. Následne E. Bolton a B. McCarthy túto techniku ​​zdokonalili návrhom metódy takzvaných DNA-agarových kolón. Táto metóda sa ukázala ako nevyhnutná pri štúdiu stupňa homológie nukleotidovej sekvencie rôznych DNA a objasnení genetického vzťahu rôznych organizmov. Denaturácia DNA objavená Dotym v kombinácii s chromatografiou na metylovanom albumíne, ktorú opísali J. Mandel a A. Hershey * (1960) a centrifugáciou v hustotnom gradiente (metódu vyvinuli v roku 1957 M. Meselson, F. Stahl a D. Winograd) sa široko používa na separáciu, izoláciu a analýzu jednotlivých komplementárnych reťazcov DNA. Napríklad W. Shibalsky (USA) pomocou týchto techník na separáciu DNA fágu lambda ukázal v rokoch 1967 - 1969, že oba fágové reťazce sú geneticky aktívny, a nie jeden, ako sa to považovalo za (S. Spiegelman, 1961). Treba poznamenať, že po prvýkrát myšlienku genetického významu oboch reťazcov DNA fágu lambda vyjadril v ZSSR SE Bresler (1961).

* (Za prácu o genetike baktérií a vírusov boli A. Hershey spolu s M. Delbrückom a S. Luriou ocenení v roku 1969 Nobelovou cenou.)

Na pochopenie organizácie a funkčnej aktivity genómu je mimoriadne dôležité určenie nukleotidovej sekvencie DNA. Hľadanie metód na takéto stanovenie prebieha v mnohých laboratóriách po celom svete. Od konca 50. rokov 20. storočia sa M. Beer a jeho spolupracovníci pokúšali v USA stanoviť sekvenciu DNA pomocou elektrónovej mikroskopie, no zatiaľ neúspešne. Začiatkom 50. rokov 20. storočia z prvých prác Sinsheimera, Chargaffa a ďalších výskumníkov o enzymatickej degradácii DNA sa zistilo, že rôzne nukleotidy v molekule DNA sú distribuované, aj keď nie náhodne, ale nerovnomerne. Podľa anglického chemika C. Bartona (1961) sú pyrimidíny (viac ako 70 %) koncentrované hlavne vo forme zodpovedajúcich blokov. A. L. Mazin a B. F. Vanyushin (1968 - 1969) zistili, že rôzne DNA majú rôzny stupeň pyrimidínovej súdržnosti a že v DNA živočíšnych organizmov sa výrazne zvyšuje, keď sa pohybuje od nižšej k vyššej. Evolúcia organizmov sa teda odráža aj v štruktúre ich genómov. Preto je pre pochopenie evolučného procesu ako celku mimoriadne dôležité porovnávacie štúdium štruktúry nukleových kyselín. Analýza štruktúry biologicky dôležitých polymérov a predovšetkým DNA je mimoriadne dôležitá pre riešenie mnohých konkrétnych problémov fylogenetiky a taxonómie.

Je zaujímavé poznamenať, že anglický fyziológ E. Lankester, ktorý študoval hemoglobíny mäkkýšov, predvídal myšlienky molekulárnej biológie presne pred 100 rokmi, napísal: „Chemické rozdiely medzi rôznymi druhmi a rodmi zvierat a rastlín sú rovnako dôležité pre objasnenie históriu ich vzniku ako ich formy. Ak by sme dokázali jasne stanoviť rozdiely v molekulárnej organizácii a fungovaní organizmov, boli by sme schopní pochopiť pôvod a vývoj rôznych organizmov oveľa lepšie ako na základe morfologických pozorovaní " * . Význam biochemických štúdií pre taxonómiu zdôraznil aj VL Komarov, ktorý napísal, že „základom všetkých aj čisto morfologických znakov, na základe ktorých klasifikujeme a zakladáme druhy, sú práve biochemické rozdiely“ ** .

* (E. R. Lankester. Uber das Vorcommen von Hemoglobin in den Muskeln der Mollusken und die Verbreitung desselben in den lebendigen Organismen.- "Pfluger" s Archiv fur die gesammte Physiol., 1871, Bd 4, 319.)

** (V. L. Komárov. Vybrané práce, zväzok 1. M.-L., Vydavateľstvo Akadémie vied ZSSR, 1945, s. 331.)

A. V. Blagoveščenskij a S. L. Ivanov už v 20. rokoch 20. storočia u nás urobili prvé kroky k objasneniu niektorých otázok evolúcie a systematiky organizmov na základe porovnávacej analýzy ich biochemického zloženia (pozri kapitolu 2). Porovnávacia analýza štruktúry proteínov a nukleových kyselín sa v súčasnosti stáva čoraz hmatateľnejším nástrojom pre taxonómov (pozri kapitolu 21). Táto metóda molekulárnej biológie umožňuje nielen objasniť postavenie jednotlivých druhov v systéme, ale tiež si vyžaduje nový pohľad na samotné princípy klasifikácie organizmov a niekedy aj revíziu celého systému ako celku, napr. stalo napríklad so systematikou mikroorganizmov. Nepochybne v budúcnosti bude analýza štruktúry genómu zaujímať ústredné miesto v chemosystematike organizmov.

Veľký význam pre rozvoj molekulárnej biológie malo dešifrovanie mechanizmov replikácie a transkripcie DNA (pozri kapitolu 24).

Biosyntéza bielkovín

Dôležitý posun v riešení problému biosyntézy bielkovín je spojený s pokrokom v štúdiu nukleových kyselín. V roku 1941 T. Kasperson (Švédsko) a v roku 1942 J. Brachet (Belgicko) upozornili na skutočnosť, že tkanivá s aktívnou syntézou bielkovín obsahujú zvýšené množstvo RNA. Dospeli k záveru, že ribonukleové kyseliny hrajú rozhodujúcu úlohu v syntéze bielkovín. Zdá sa, že v roku 1953 E. Gale a D. Fox dostali priamy dôkaz o priamom zapojení RNA do biosyntézy proteínov: podľa ich údajov ribonukleáza výrazne potláčala inkorporáciu aminokyselín do lyzátov bakteriálnych buniek. Podobné údaje získali V. Olfri, M. Delhi a A. Mirsky (1953) na pečeňových homogenátoch. Neskôr E. Gale odmietol správnu myšlienku, ktorú vyslovil o vedúcej úlohe RNA v syntéze bielkovín, mylne sa domnievajúc, že ​​k aktivácii syntézy bielkovín v bezbunkovom systéme dochádza pod vplyvom nejakej inej látky neznámej povahy. V roku 1954 P. Zamechnik, D. Littlefield, R. B. Khesin-Lurie a ďalší zistili, že k najaktívnejšiemu inkorporovaniu aminokyselín dochádza vo frakciách subcelulárnych častíc bohatých na RNA – mikrozómoch. P. Zamechnik a E. Keller (1953 - 1954) zistili, že inkorporácia aminokyselín sa výrazne zvýšila v prítomnosti supernatantu v podmienkach regenerácie ATP. P. Sikevitz (1952) a M. Hoagland (1956) izolovali zo supernatantu proteínovú frakciu (frakcia pH 5), ktorá bola zodpovedná za ostrú stimuláciu inklúzie aminokyselín do mikrozómov. Spolu s proteínmi bola v supernatante nájdená špeciálna trieda RNA s nízkou molekulovou hmotnosťou, teraz nazývaná transferová RNA (tRNA). V roku 1958 Hoagland a Zamechnik, ako aj P. Berg, R. Sweet a F. Allen a mnohí ďalší výskumníci zistili, že každá aminokyselina vyžaduje na aktiváciu svoj vlastný špeciálny enzým, ATP a špecifickú tRNA. Ukázalo sa, že tRNA vykonávajú výlučne funkciu adaptérov, teda zariadení, ktoré nachádzajú miesto na nukleovej matrici (mRNA) pre zodpovedajúcu aminokyselinu vo vznikajúcej molekule proteínu. Tieto štúdie plne potvrdili adaptorovú hypotézu F. Cricka (1957), ktorá predpokladala existenciu polynukleotidových adaptérov v bunke nevyhnutných pre správne usporiadanie aminokyselinových zvyškov syntetizovaného proteínu na nukleárnej matrici. Oveľa neskôr francúzsky vedec F. Chapville (1962) v laboratóriu F. Lipmana (Nobelova cena, 1953) v USA veľmi dômyselne a jednoznačne ukázal, že umiestnenie aminokyseliny v molekule syntetizovaného proteínu je úplne určené tzv. špecifickú tRNA, ku ktorej je pripojený. Crickovu hypotézu adaptéra vyvinuli Hoagland a Zamechnik.

Do roku 1958 sa stali známymi tieto hlavné štádiá syntézy proteínov: 1) aktivácia aminokyseliny špecifickým enzýmom z „frakcie pH 5“ v prítomnosti ATP za vzniku aminoacyladenylátu; 2) pripojenie aktivovanej aminokyseliny na špecifickú tRNA s uvoľnením adenozínmonofosfátu (AMP); 3) väzba aminoacyl-tRNA (tRNA nabitá aminokyselinou) na mikrozómy a inkorporácia aminokyselín do proteínu s uvoľnením tRNA. Hoagland (1958) poznamenal, že guanozíntrifosfát (GTP) je potrebný v poslednom štádiu proteínovej syntézy.

Transfer RNA a génová syntéza

Po objavení tRNA sa začalo aktívne pátranie po ich frakcionácii a určovaní nukleotidovej sekvencie. Najväčší úspech dosiahol americký biochemik R. Holly. V roku 1965 stanovil štruktúru alanínovej tRNA z kvasiniek. Holly pomocou ribonukleáz (guanyl RNázy a pankreatickej RNázy) rozdelila molekulu nukleovej kyseliny na niekoľko fragmentov, v každom z nich samostatne určila nukleotidovú sekvenciu a následne zrekonštruovala sekvenciu celej molekuly alanínovej tRNA. Tento spôsob analýzy nukleotidovej sekvencie sa nazýva bloková metóda. Hollého zásluha spočívala najmä v tom, že sa naučil deliť molekulu RNA nielen na malé kúsky, ako to robili mnohí pred ním, ale aj na veľké fragmenty (štvrtiny a polovice). To mu poskytlo príležitosť správne zostaviť jednotlivé malé kúsky dohromady a tým vytvoriť kompletnú nukleotidovú sekvenciu celej molekuly tRNA (Nobelova cena, 1968).

Táto technika bola okamžite prijatá mnohými laboratóriami po celom svete. V priebehu nasledujúcich dvoch rokov bola v ZSSR a v zahraničí dešifrovaná primárna štruktúra niekoľkých tRNA. A. A. Baev (1967) a spolupracovníci po prvýkrát stanovili nukleotidovú sekvenciu v kvasinkovej valínovej tRNA. K dnešnému dňu sa študovalo viac ako tucet rôznych individuálnych tRNA. Zvláštny rekord v určovaní nukleotidovej sekvencie zaznamenali v Cambridge F. Senger a G. Brownlee. Títo výskumníci vyvinuli prekvapivo elegantnú metódu na separáciu oligonukleotidov a sekvenovanie takzvanej 5S (ribozomálnej) RNA z buniek E. coli (1968). Táto RNA pozostáva zo 120 nukleotidových zvyškov a na rozdiel od tRNA neobsahuje ďalšie minoritné bázy, ktoré značne uľahčujú analýzu nukleotidovej sekvencie a slúžia ako jedinečné orientačné body pre jednotlivé fragmenty molekuly. V súčasnosti vďaka použitiu Sangerovej a Brownleeovej metódy úspešne napredujú práce na štúdiu sekvencie dlhých ribozomálnych RNA a niektorých vírusových RNA v laboratóriu J. Ebela (Francúzsko) a ďalších výskumníkov.

A. A. Baev a kolegovia (1967) zistili, že valínová tRNA rozrezaná na polovicu obnovuje svoju makromolekulárnu štruktúru v roztoku a napriek defektu v primárnej štruktúre má funkčnú aktivitu pôvodnej (natívnej) molekuly. Tento prístup – rekonštrukcia narezanej makromolekuly po odstránení určitých fragmentov – sa ukázal ako veľmi sľubný. V súčasnosti sa široko používa na objasnenie funkčnej úlohy jednotlivých sekcií určitých tRNA.

V posledných rokoch sa dosiahol veľký úspech pri získavaní kryštalických preparátov jednotlivých tRNA. Mnoho tRNA už bolo vykryštalizovaných vo viacerých laboratóriách v USA a Anglicku. To umožnilo študovať štruktúru tRNA pomocou rôntgenovej difrakčnej analýzy. V roku 1970 predstavil R. Bock prvé röntgenové obrazce a trojrozmerné modely niekoľkých tRNA, ktoré vytvoril na Wisconsinskej univerzite. Tieto modely pomáhajú určiť lokalizáciu jednotlivých funkčne aktívnych miest v tRNA a pochopiť základné princípy fungovania týchto molekúl.

Prvoradý význam pre odhalenie mechanizmu syntézy bielkovín a vyriešenie problému špecifickosti tohto procesu malo rozlúštenie podstaty genetického kódu (pozri kapitolu 24), ktoré možno bez preháňania považovať za popredné miesto tzv. prírodné vedy 20. storočia.

Objav primárnej štruktúry tRNA R. Hollyho dal podnet k práci G. Korana * (USA) na syntéze oligonukleotidov a nasmeroval ich k syntéze špecifickej biologickej štruktúry - molekuly DNA kódujúcej alanínovú tRNA. Prvé kroky v chemickej syntéze krátkych oligonukleotidov, ktoré urobil Korán takmer pred 15 rokmi, vyvrcholili v roku 1970 prvou génovou syntézou. Korán a jeho spolupracovníci najskôr chemicky syntetizovali krátke fragmenty 8-12 nukleotidových zvyškov z jednotlivých nukleotidov. Tieto fragmenty s danou nukleotidovou sekvenciou tvorili spontánne dvojvláknové komplementárne kúsky s prekrytím 4–5 nukleotidov. Potom sa tieto hotové kusy spojili do jedného konca v správnom poradí pomocou enzýmu DNA ligázy. Na rozdiel od replikácie molekúl DNA sa teda podľa A. Kornberga ** (pozri kapitolu 24) podarilo v Koráne znovu vytvoriť prirodzenú dvojvláknovú molekulu DNA podľa vopred naplánovaného programu v súlade s tzv. sekvencia tRNA opísaná Hollym. Podobne teraz prebiehajú práce na syntéze ďalších génov (M. N. Kolosov, Z. A. Shabarova, D. G. Knorre, 1970 - 1975).

* (Za štúdium genetického kódu dostali v roku 1968 G. Korán a M. Nirenberg Nobelovu cenu.)

** (Za objav polymerázy a syntézy DNA A. Kornberg a za syntézu RNA získal S. Ochoa v roku 1959 Nobelovu cenu.)

Mikrozómy, ribozómy, preklad

V polovici 50. rokov 20. storočia sa verilo, že mikrozómy sú centrom syntézy bielkovín v bunke. Termín mikrozómy prvýkrát zaviedol v roku 1949 A. Claude na označenie frakcie malých granúl. Neskôr sa ukázalo, že za syntézu proteínov nie je zodpovedná celá frakcia mikrozómov pozostávajúca z membrán a granúl, ale iba malé častice ribonukleoproteínu. Tieto častice v roku 1958 nazval R. Roberts ribozómy.

Klasické štúdie bakteriálnych ribozómov uskutočnili A. Tisier a J. Watson v rokoch 1958-1959. Ukázalo sa, že bakteriálne ribozómy sú o niečo menšie ako rastlinné a živočíšne. J. Littleton (1960), M. Clark (1964) a E. N. Svetailo (1966) ukázali, že ribozómy chloroplastov vyšších rastlín a mitochondrií patria k bakteriálnemu typu. A. Tisier a iní (1958) zistili, že ribozómy sa disociujú na dve nerovnaké podjednotky obsahujúce každú jednu molekulu RNA. Koncom 50. rokov sa verilo, že každá molekula ribozomálnej RNA pozostáva z niekoľkých krátkych fragmentov. AS Spirin však v roku 1960 ako prvý ukázal, že RNA v subčasticiach je reprezentovaná súvislou molekulou. D. Waller (1960), ktorý oddelil ribozomálne proteíny pomocou elektroforézy na škrobovom géli, zistil, že sú veľmi heterogénne. Spočiatku mnohí pochybovali o Wallerových údajoch, pretože sa zdalo, že ribozómový proteín by mal byť prísne homogénny, ako napríklad proteín TMV. V súčasnosti, ako výsledok výskumu D. Wallera, R. Trouta, P. Trauba a ďalších biochemikov, sa zistilo, že zloženie skutočných ribozomálnych častíc zahŕňa viac ako 50 proteínov, ktoré sú v štruktúre úplne odlišné. AS Spirin v roku 1963 ako prvý rozvinul ribozomálne subčastice a ukázal, že ribozómy sú kompaktne skrútené ribonukleoproteínové vlákno, ktoré sa môže za určitých podmienok rozvinúť. V rokoch 1967-1968 M. Nomura kompletne zrekonštruoval biologicky aktívnu podjednotku z ribozomálnej RNA a proteínu a dokonca získal ribozómy, v ktorých proteín a RNA patrili rôznym mikroorganizmom.

Úloha ribozomálnej RNA je stále nejasná. Predpokladá sa, že ide o tú unikátnu špecifickú matricu, na ktorej si pri tvorbe ribozomálnej častice každý z početných ribozomálnych proteínov nájde presne definované miesto (AS Spirin, 1968).

A. Rich (1962) objavil agregáty niekoľkých ribozómov prepojených reťazcom mRNA. Tieto komplexy sa nazývali polyzómy. Objav polyzómov umožnil Richovi a Watsonovi (1963) navrhnúť, že k syntéze polypeptidového reťazca dochádza na ribozóme, ktorý sa akoby pohybuje pozdĺž reťazca mRNA. Keď sa ribozóm pohybuje pozdĺž reťazca mRNA, informácie sa čítajú v častici a vytvára sa proteínový polypeptidový reťazec a nové ribozómy sa striedavo pripájajú k uvoľnenému čítaciemu koncu mRNA. Z údajov Richa a Watsona vyplynulo, že význam polyzómov v bunke spočíva v hromadnej produkcii proteínu postupným čítaním matrice niekoľkými ribozómami naraz.

Výsledkom výskumu M. Nirenberga, S. Ochoa, F. Lipmana, G. Korana a iných v rokoch 1963 - 1970. bolo známe, že spolu s mRNA, ribozómami, ATP a aminoacyl-tRNA sa na procese translácie podieľa veľké množstvo rôznych faktorov a samotný proces translácie možno podmienečne rozdeliť do troch štádií - iniciácia, samotná translácia a ukončenie.

Iniciácia translácie znamená syntézu prvej peptidovej väzby v komplexe ribozóm - templátový polynukleotid - aminoacyl-tRNA. Takúto iniciačnú aktivitu nemá žiadna aminoacyl-tRNA, ale formylmetionyl-tRNA. Túto látku prvýkrát izolovali v roku 1964 F. Senger a K. Marker. S. Bretcher a K. Marker (1966) ukázali, že iniciačná funkcia formylmetionyl-tRNA je spôsobená jej zvýšenou afinitou k peptidylovému centru ribozómu. Pre začiatok translácie sú mimoriadne dôležité aj niektoré proteínové iniciačné faktory, ktoré boli izolované v laboratóriách S. Ochoa, F. Gro a iných výskumných centier. Po vytvorení prvej peptidovej väzby v ribozóme začína samotná translácia, teda postupná adícia aminoacylového zvyšku na C-koniec polypeptidu. Mnohé detaily procesu prekladu študovali K. Monroe a J. Bishop (Anglicko), I. Rykhlik a F. Shorm (Československo), F. Lipman, M. Bretcher, W. Gilbert (USA) a ďalší bádatelia. V roku 1968 A. S. Spirin navrhol originálnu hypotézu na vysvetlenie mechanizmu ribozómu. Hnacím mechanizmom, ktorý zabezpečuje všetky priestorové pohyby tRNA a mRNA počas translácie, je periodické otváranie a zatváranie ribozómových subčastíc. Terminácia translácie je zakódovaná v samotnej čitateľnej matrici, ktorá obsahuje terminačné kodóny. Ako ukázal S. Brenner (1965 - 1967), takýmito kodónmi sú triplety UAA, UAG a UGA. M. Capecci (1967) tiež identifikoval špeciálne proteínové terminačné faktory. AS Spirin a LP Gavrilova opísali takzvanú „neenzymatickú“ syntézu proteínov v ribozómoch (1972 - 1975) bez účasti proteínových faktorov. Tento objav je dôležitý pre pochopenie pôvodu a vývoja biosyntézy bielkovín.

Regulácia aktivity génov a proteínov

Po probléme špecifickosti syntézy proteínov sa v molekulárnej biológii ukázal na prvom mieste problém regulácie syntézy proteínov, alebo, čo je to isté, regulácie aktivity génov.

Funkčná neekvivalencia buniek a s ňou spojená represia a aktivácia génov dlho priťahovali pozornosť genetikov, ale až donedávna zostával skutočný mechanizmus kontroly génovej aktivity neznámy.

Prvé pokusy vysvetliť regulačnú aktivitu génov súviseli so štúdiom histónových proteínov. Dokonca aj manželia Steadmanovci * na začiatku 40. rokov XX. naznačil, že sú to históny, ktoré môžu hrať hlavnú úlohu v tomto fenoméne. Následne získali prvé jasné údaje o rozdieloch v chemickej povahe histónových proteínov. V súčasnosti sa každým rokom zvyšuje počet faktov svedčiacich v prospech tejto hypotézy.

* (E. Stedman, E. Stedman. Základné bielkoviny bunkových jadier.- Filozof. Trans. Roy. soc. Londýn, 1951, v. 235, 565 - 595.)

Zároveň sa hromadí čoraz väčšie množstvo údajov, čo naznačuje, že regulácia génovej aktivity je oveľa zložitejší proces ako jednoduchá interakcia génových úsekov s molekulami histónového proteínu. V rokoch 1960-1962 v laboratóriu R. B. Khesin-Lurie sa zistilo, že fágové gény sa začínajú čítať nesúčasne: T2 fágové gény možno rozdeliť na skoré gény, ktorých fungovanie sa vyskytlo v prvých minútach infekcie bakteriálnej bunky , a neskoré, ktoré začali syntetizovať mRNA po dokončení práce skorých génov.

V roku 1961 navrhli francúzski biochemici F. Jacob a J. Monod schému regulácie génovej aktivity, ktorá zohrala výnimočnú úlohu v pochopení regulačných mechanizmov bunky vo všeobecnosti. Podľa schémy Jacoba a Monoda obsahuje DNA okrem štruktúrnych (informačných) génov aj gény-regulátory a gény-operátory. Regulačný gén kóduje syntézu špecifickej látky - represora, ktorý sa môže pripojiť k induktoru aj k operátorovému génu. Operátorový gén je spojený so štrukturálnymi génmi, zatiaľ čo regulačný gén sa nachádza v určitej vzdialenosti od nich. Ak v prostredí nie je žiadny induktor, napríklad laktóza, potom sa represor syntetizovaný regulačným génom naviaže na operátorový gén a jeho zablokovaním vypne prácu celého operónu (blok štrukturálnych génov spolu s operátorom ktorý ich ovláda). Za týchto podmienok nedochádza k tvorbe enzýmov. Ak sa v médiu objaví induktor (laktóza), potom sa produkt regulačného génu, represor, naviaže na laktózu a odstráni blok z génu operátora. V tomto prípade je možná práca štruktúrneho génu kódujúceho syntézu enzýmu a enzým (laktóza) sa objaví v médiu.

Podľa Jacoba a Monoda je táto regulačná schéma aplikovateľná na všetky adaptívne enzýmy a môže prebiehať ako počas represie, keď je tvorba enzýmu potlačená nadbytkom reakčného produktu, tak aj počas indukcie, keď zavedenie substrátu spôsobuje syntéza enzýmu. Za štúdie regulácie génovej aktivity dostali Jacob a Monod v roku 1965 Nobelovu cenu.

Spočiatku sa táto schéma zdala príliš pritiahnutá. Neskôr sa však ukázalo, že regulácia génov podľa tohto princípu neprebieha len v baktériách, ale aj v iných organizmoch.

Od roku 1960 zaujíma popredné miesto v molekulárnej biológii štúdie organizácie genómu a štruktúry chromatínu v eukaryotických organizmoch (J. Bonner, R. Britten, W. Olfrey, P. Walker, Yu. S. Chentsov , I. B. Zbarsky a ďalší.) a regulácia transkripcie (A. Mirsky, G. P. Georgiev, M. Bernstiel, D. Goll, R. Tsanev, R. I. Salganik). Povaha represora zostala dlho neznáma a kontroverzná. V roku 1968 M. Ptashne (USA) ukázal, že proteín je represor. Izoloval ho v laboratóriu J. Watsona a zistil, že represor má skutočne afinitu k induktoru (laktóze) a zároveň „rozpoznáva“ operátorový gén lac operónu a špecificky sa naň viaže.

V posledných 5 - 7 rokoch boli získané údaje o prítomnosti ďalšej kontrolnej bunky génovej aktivity - promótora. Ukázalo sa, že vedľa miesta operátora, na ktoré je naviazaný produkt syntetizovaný na génovom regulátore - bielkovinová substancia represora, sa nachádza ďalšie miesto, ktoré by sa malo pripísať aj členom regulačného systému génu. činnosť. Na toto miesto je pripojená proteínová molekula enzýmu RNA polymeráza. V promótorovej oblasti musí nastať vzájomné rozpoznanie jedinečnej nukleotidovej sekvencie v DNA a špecifickej konfigurácie proteínu RNA polymerázy. Implementácia procesu čítania genetickej informácie s danou sekvenciou génov operónu susediaceho s promótorom bude závisieť od účinnosti rozpoznávania.

Okrem schémy, ktorú opísali Jacob a Monod, existujú v bunke aj iné mechanizmy génovej regulácie. F. Jacob a S. Brenner (1963) zistili, že regulácia replikácie bakteriálnej DNA je určitým spôsobom riadená bunkovou membránou. Experimenty Jacoba (1954) o indukcii rôznych profágov presvedčivo ukázali, že pod vplyvom rôznych mutagénnych faktorov v bunke lyzogénnych baktérií začína selektívna replikácia profágového génu a je blokovaná replikácia hostiteľského genómu. V roku 1970 F. Bell oznámil, že malé molekuly DNA môžu prejsť z jadra do cytoplazmy a tam sa prepísať.

Génová aktivita môže byť teda regulovaná na úrovni replikácie, transkripcie a translácie.

Významný pokrok sa dosiahol v štúdiu regulácie nielen syntézy enzýmov, ale aj ich aktivity. A. Novik a L. Szilard poukázali na fenomény regulácie aktivity enzýmov v bunke už v 50. rokoch 20. storočia. G. Umbarger (1956) zistil, že v bunke existuje veľmi racionálny spôsob potlačenia aktivity enzýmu konečným produktom spätnoväzbového reťazca reakcií. Ako stanovili J. Monod, J. Change, F. Jacob, A. Purdy a ďalší výskumníci (1956 - 1960), regulácia aktivity enzýmov sa môže uskutočňovať podľa alosterického princípu. Enzým alebo jedna z jeho podjednotiek má okrem afinity k substrátu aj afinitu k jednému z produktov reakčného reťazca. Pod vplyvom takéhoto signálneho produktu mení enzým svoju konformáciu takým spôsobom, že stráca aktivitu. Tým sa hneď na začiatku vypne celý reťazec enzymatických reakcií. D. Wieman a R. Woodward (1952; nositeľ Nobelovej ceny, 1965) poukázali na podstatnú úlohu konformačných zmien proteínov v enzymatických reakciách av určitom zmysle na prítomnosť alosterického účinku.

Štruktúra a funkcia bielkovín

Výsledkom práce T. Osborna, G. Hofmeistera, A. Gurbera, F. Schulza a mnohých ďalších na konci 19. storočia. Mnoho živočíšnych a rastlinných bielkovín bolo získaných v kryštalickej forme. Približne v rovnakom čase sa pomocou rôznych fyzikálnych metód stanovili molekulové hmotnosti určitých proteínov. Takže v roku 1891 A. Sabaneev a N. Alexandrov oznámili, že molekulová hmotnosť ovalbumínu je 14 000; v roku 1905 E. Reid zistil, že molekulová hmotnosť hemoglobínu je 48 000. Polymérnu štruktúru proteínov objavili v roku 1871 G. Glasivetz a D. Gaberman. Myšlienku peptidovej väzby jednotlivých aminokyselinových zvyškov v proteínoch predložil T. Curtius (1883). Práca o chemickej kondenzácii aminokyselín (E. Schaal, 1871; G. Schiff, 1897; L. Balbiano a D. Traschiatti, 1900) a syntéze heteropolypeptidov (E. Fisher, 1902 - 1907, Nobelova cena, 1902) viedol k vývoju základných princípov chemickej štruktúry bielkovín.

Prvý kryštalický enzým (ureázu) získal v roku 1926 J. Sumner (Nobelova cena, 1946) a v roku 1930 J. Northrop (Nobelova cena, 1946) získal kryštalický pepsín. Po týchto prácach sa ukázalo, že enzýmy sú bielkovinovej povahy. V roku 1940 M. Kunits izoloval kryštalickú RNázu. Do roku 1958 už bolo známych viac ako 100 kryštalických enzýmov a viac ako 500 nekryštalických enzýmov. Získanie vysoko purifikovaných preparátov jednotlivých proteínov prispelo k rozlúšteniu ich primárnej štruktúry a makromolekulárnej organizácie.

Veľký význam pre rozvoj molekulárnej biológie všeobecne a genetiky človeka zvlášť mal objav L. Paulinga (1940) abnormálneho hemoglobínu S, izolovaného z erytrocytov ľudí s ťažkým dedičným ochorením, kosáčikovitou anémiou. V rokoch 1955-1957 W. Ingram použil na analýzu produktov hydrolýzy hemoglobínu S alkáliou a trypsínom metódu "fingerprint" vyvinutú F. Sangerom (škvrny tvorené jednotlivými peptidmi pri chromatografii na papieri). V roku 1961 Ingram uviedol, že hemoglobín S sa líši od normálneho hemoglobínu iba povahou jedného aminokyselinového zvyšku: v normálnom hemoglobíne je zvyšok kyseliny glutámovej na siedmej pozícii reťazca a v hemoglobíne S je valínový zvyšok. Tak sa plne potvrdil Paulingov predpoklad (1949), že kosáčikovitá anémia je choroba molekulárnej povahy. Zdedená zmena len jedného aminokyselinového zvyšku v každej polovici makromolekuly hemoglobínu vedie k tomu, že hemoglobín pri nízkej koncentrácii kyslíka stráca schopnosť ľahko sa rozpúšťať a začína kryštalizovať, čo vedie k narušeniu bunkovej štruktúry. Tieto štúdie jasne ukázali, že štruktúra proteínu je presne definovaná aminokyselinová sekvencia, ktorá je kódovaná v genóme. Práce K. Anfinsena (1951) svedčili o výnimočnom význame primárnej štruktúry proteínu pri tvorbe unikátnej biologicky aktívnej konformácie makromolekuly. Anfinsen ukázal, že biologicky aktívna makroštruktúra pankreatickej ribonukleázy, ktorá sa stráca v dôsledku obnovy, je vopred určená sekvenciou aminokyselín a môže sa spontánne objaviť počas oxidácie SH skupín cysteínových zvyškov s tvorbou disulfidových zosieťovaní v striktne definované miesta peptidového reťazca enzýmu.

Doteraz bol podrobne študovaný mechanizmus účinku veľkého množstva enzýmov a bola stanovená štruktúra mnohých proteínov.

V roku 1953 F. Sanger stanovil aminokyselinovú sekvenciu inzulínu. : Tento proteín pozostáva z dvoch polypeptidových reťazcov spojených dvoma disulfidovými zosieťovanými väzbami. Jeden z reťazcov obsahuje iba 21 aminokyselinových zvyškov, zatiaľ čo druhý obsahuje 30 zvyškov. Sanger strávil asi 10 rokov dešifrovaním štruktúry tohto relatívne jednoduchého proteínu. V roku 1958 mu bola za tento výnimočný výskum udelená Nobelova cena. Po vytvorení automatického analyzátora aminokyselín V. Steinom a S. Moorom (1957) sa výrazne urýchlila identifikácia produktov čiastočnej hydrolýzy bielkovín. V roku 1960 o tom informovali už Stein a Moore. že dokázali určiť sekvenciu ribonukleázy, ktorej peptidový reťazec predstavuje 124 aminokyselinových zvyškov. V tom istom roku v laboratóriu G. Schramma v Tübingene (Nemecko) F. Anderer a ďalší určili sekvenciu aminokyselín v proteíne TMV. Potom sa určila aminokyselinová sekvencia v myoglobíne (A. Edmunson) a α- a β-reťazcoch ľudského hemoglobínu (G. Braunitzer, E. Schroeder atď.), lyzozým z vaječného proteínu (J. Jollet, D. Keyfield) . V roku 1963 F. Shorm a B. Keil (Československo) stanovili sekvenciu aminokyselín v molekule chymotrypsinogénu. V tom istom roku bola stanovená sekvencia aminokyselín trypsinogénu (F. Shorm, D. Walsh). V roku 1965 K. Takahashi stanovil primárnu štruktúru ribonukleázy T1. Potom sa určila sekvencia aminokyselín pre niekoľko ďalších proteínov.

Ako je známe, konečným dôkazom správnosti definície konkrétnej štruktúry je jej syntéza. V roku 1969 R. Merifield (USA) ako prvý uskutočnil chemickú syntézu pankreatickej ribonukleázy. Pomocou metódy syntézy, ktorú vyvinul na nosiči na pevnej fáze, Merifield pridával jednu aminokyselinu za druhou do reťazca v súlade so sekvenciou, ktorú opísali Stein a Moore. V dôsledku toho dostal proteín, ktorý bol svojimi kvalitami identický s pankreatickou ribonukleázou A. Za objav štruktúry ribonukleázy dostali V. Stein, S. Moore a K. Anfinsen v roku 1972 Nobelovu cenu. Táto prirodzená syntéza proteínov otvára obrovské vyhliadky a poukazuje na možnosť vytvorenia akýchkoľvek proteínov v súlade s vopred naplánovanou sekvenciou.

Z röntgenových štúdií W. Astburyho (1933) vyplynulo, že peptidové reťazce proteínových molekúl sú skrútené alebo naskladané nejakým presne definovaným spôsobom. Odvtedy mnohí autori vyjadrili rôzne hypotézy o spôsoboch skladania proteínových reťazcov, ale až do roku 1951 zostali všetky modely špekulatívnymi konštrukciami, ktoré nezodpovedali experimentálnym údajom. V roku 1951 L. Pauling a R. Corey publikovali sériu brilantných prác, v ktorých bola konečne sformulovaná teória sekundárnej štruktúry bielkovín, teória α-helixu. Spolu s tým sa tiež zistilo, že proteíny majú tiež terciárnu štruktúru: a-helix peptidového reťazca môže byť zložený určitým spôsobom, čím sa vytvorí pomerne kompaktná štruktúra.

V roku 1957 J. Kendrew a jeho spolupracovníci prvýkrát navrhli trojrozmerný model štruktúry myoglobínu. Tento model sa potom niekoľko rokov zdokonaľoval, až kým sa v roku 1961 neobjavila záverečná práca s charakterizáciou priestorovej štruktúry tohto proteínu. V roku 1959 M. Perutz a kolegovia stanovili trojrozmernú štruktúru hemoglobínu. Výskumníci strávili na tejto práci viac ako 20 rokov (prvé röntgenové snímky hemoglobínu získal Perutz v roku 1937). Pretože molekula hemoglobínu pozostáva zo štyroch podjednotiek, po rozlúštení jej organizácie, Perutz prvýkrát opísal kvartérnu štruktúru proteínu. Za prácu na určovaní trojrozmernej štruktúry proteínov získali Kendrew a Perutz v roku 1962 Nobelovu cenu.

Vytvorenie priestorového modelu štruktúry hemoglobínu podľa Perutza POVOLENÉ. priblížiť sa k pochopeniu mechanizmu fungovania tohto proteínu, ktorý, ako je známe, vykonáva transport kyslíka v živočíšnych bunkách. Ešte v roku 1937 F. Gaurowitz dospel k záveru, že interakcia hemoglobínu s kyslíkom, vzduchom by mala byť sprevádzaná zmenou štruktúry proteínu. V 60. rokoch 20. storočia Perutz a spolupracovníci objavili badateľný posun v reťazcoch hemoglobínu po jeho oxidácii, spôsobený posunom atómov železa v dôsledku väzby s kyslíkom. Na tomto základe vznikli predstavy o „dýchaní“ proteínových makromolekúl.

V roku 1960 D. Phillips a jeho spolupracovníci začali so štúdiom röntgenovej difrakcie molekuly lyzozýmu. Do roku 1967 boli viac-menej schopní zistiť podrobnosti o organizácii tohto proteínu a lokalizácii jednotlivých atómov v jeho molekule. Okrem toho Phillips zistil povahu pridania lyzozýmu do substrátu (triacetylglukózamín). To umožnilo znovu vytvoriť mechanizmus tohto enzýmu. Znalosť primárnej štruktúry a makromolekulovej organizácie teda umožnila nielen zistiť povahu aktívnych centier mnohých enzýmov, ale aj plne odhaliť mechanizmus fungovania týchto makromolekúl.

Využitie metód elektrónovej mikroskopie pomohlo odhaliť princípy makromolekulárnej organizácie takých zložitých proteínových útvarov, akými sú kolagén, fibrinogén, kontraktilné svalové fibrily a pod. Koncom 50. rokov boli navrhnuté modely svalového kontraktilného aparátu. Mimoriadny význam pre pochopenie mechanizmu svalovej kontrakcie mal objav V. A. Engelgardta a M. N. Lyubimovej (1939) o ATPázovej aktivite myozínu. To znamenalo, že akt svalovej kontrakcie je založený na zmene fyzikálno-chemických vlastností a makromolekulárnej organizácie kontraktilného proteínu pod vplyvom kyseliny adenozíntrifosforečnej (pozri tiež kapitolu 11).

Virologický výskum bol nevyhnutný na pochopenie princípov zostavovania biologických štruktúr (pozri kapitolu 25).

Nevyriešené problémy

Hlavné pokroky v modernej molekulárnej biológii sa dosiahli najmä vďaka štúdiu nukleových kyselín. Ani v tejto oblasti však zďaleka nie sú všetky problémy vyriešené. Veľké úsilie si bude vyžadovať najmä dešifrovanie celej nukleotidovej sekvencie genómu. Tento problém je zas neoddeliteľne spojený s problémom heterogenity DNA a vyžaduje si vývoj nových pokročilých metód frakcionácie a izolácie jednotlivých molekúl z celkového genetického materiálu bunky.

Doteraz sa úsilie sústreďovalo hlavne na samostatné štúdium proteínov a nukleových kyselín. V bunke sú tieto biopolyméry navzájom neoddeliteľne spojené a fungujú najmä vo forme nukleoproteínov. Potreba študovať interakciu proteínov a nukleových kyselín sa preto teraz stala obzvlášť akútnou. Do popredia sa dostáva problém rozpoznávania určitých úsekov nukleových kyselín proteínmi. Kroky na štúdium takejto interakcie týchto biopolymérov už boli načrtnuté, bez ktorých je úplné pochopenie štruktúry a funkcií chromozómov, ribozómov a iných štruktúr nemysliteľné. Bez toho je tiež nemožné pochopiť reguláciu génovej aktivity a nakoniec dešifrovať princípy práce mechanizmov syntetizujúcich proteíny. Po práci Jacoba a Monoda sa objavili nové údaje o regulačnom význame membrán pri syntéze jadrového materiálu. To predstavuje problém hlbšieho štúdia úlohy membrán v regulácii replikácie DNA. Vo všeobecnosti sa problém regulácie génovej aktivity a bunkovej aktivity vo všeobecnosti stal jedným z najdôležitejších problémov modernej molekulárnej biológie.

Súčasný stav biofyziky

V úzkej súvislosti s problémami molekulárnej biológie napredoval rozvoj biofyziky. Záujem o túto oblasť biológie podnietila na jednej strane potreba komplexného štúdia vplyvu rôznych druhov žiarenia na organizmus a na druhej strane potreba štúdia fyzikálnych a fyzikálno-chemické základy životných javov vyskytujúcich sa na molekulárnej úrovni.

Získavanie presných informácií o molekulárnych štruktúrach a procesoch v nich prebiehajúcich bolo možné vďaka použitiu nových jemných fyzikálnych a chemických metód. Na základe výdobytkov elektrochémie bolo možné zlepšiť metódu merania bioelektrických potenciálov použitím iónovo selektívnych elektród (G. Eisenman, B.P. Nikolsky, Khuri, 50-60s). Čoraz častejšie sa do praxe dostáva infračervená spektroskopia (s využitím laserových prístrojov), ktorá umožňuje študovať konformačné zmeny proteínov (I. Plotnikov, 1940). Cenné informácie poskytuje aj metóda elektrónovej paramagnetickej rezonancie (E. K. Zavoisky, 1944) a biochemiluminiscenčná metóda (B. N. Tarusov et al., 1960), ktoré umožňujú predovšetkým posudzovať transport elektrónov pri oxidačných procesoch.

V 50. rokoch 20. storočia už biofyzika získavala silné postavenie. Je potrebné vychovať kvalifikovaných odborníkov. Ak v roku 1911 mala v Európe katedru biofyziky iba Univerzita v Pécsi v Maďarsku, potom v roku 1973 takéto katedry existovali takmer na všetkých veľkých univerzitách.

V roku 1960 bola zorganizovaná Medzinárodná spoločnosť biofyzikov. V auguste 1961 sa v Štokholme konal prvý medzinárodný biofyzikálny kongres. Druhý kongres sa konal v roku 1965 v Paríži, tretí - v roku 1969 v Bostone, štvrtý - v roku 1972 v Moskve.

V biofyzike je zreteľný rozdiel medzi dvoma oblasťami rôzneho obsahu – molekulárnou biofyzikou a bunkovou biofyzikou. Toto rozlíšenie dostáva aj organizačný výraz: vytvárajú sa samostatné oddelenia týchto dvoch oblastí biofyziky. Na Moskovskej univerzite bola prvá katedra biofyziky vytvorená v roku 1953 na Fakulte biológie a pedológie a o niečo neskôr sa katedra biofyziky objavila na Fyzikálnej fakulte. Katedry boli organizované na rovnakom princípe na mnohých iných univerzitách.

Molekulárna biofyzika

V posledných rokoch sa spojenie medzi molekulárnou biofyzikou a molekulárnou biológiou stále viac posilňuje a v súčasnosti je niekedy ťažké určiť, kde medzi nimi leží deliaca čiara. Pri všeobecnom útoku na problém dedičnej informácie je takáto spolupráca medzi biofyzikou a molekulárnou biológiou nevyhnutná.

Hlavným smerom vo výskumnej práci je štúdium fyziky nukleových kyselín - DNA a RNA. Použitie vyššie uvedených metód a predovšetkým röntgenová difrakčná analýza prispela k dešifrovaniu molekulárnej štruktúry nukleových kyselín. V súčasnosti prebieha intenzívny výskum na štúdium správania sa týchto kyselín v roztokoch. Osobitná pozornosť sa venuje konformačným prechodom "helix-coil", ktoré sa študujú zmenami viskozity, optických a elektrických parametrov. V súvislosti so štúdiom mechanizmov mutagenézy sa rozvíjajú štúdie na štúdium vplyvu ionizujúceho žiarenia na správanie sa nukleových kyselín v roztokoch, ako aj vplyvu žiarenia na nukleové kyseliny vírusov a fágov. Účinok ultrafialového žiarenia, o ktorom je známe, že niektoré spektrálne oblasti sú dobre absorbované nukleovými kyselinami, bol podrobený komplexnej analýze. Veľký podiel na tomto druhu výskumu má detekcia aktívnych radikálov nukleových kyselín a proteínov metódou elektrónovej paramagnetickej rezonancie. S použitím tejto metódy je spojený vznik celého nezávislého smeru.

Problém kódovania informácií DNA a RNA a ich prenosu počas syntézy proteínov je dlhodobo predmetom záujmu molekulárnej biofyziky a fyzici opakovane vyjadrili určité úvahy na túto tému (E. Schrödinger, G. Gamow). Rozlúštenie genetického kódu vyvolalo početné teoretické a experimentálne štúdie o štruktúre špirály DNA, o mechanizme kĺzania a krútenia jej závitov a o štúdiu fyzikálnych síl zapojených do týchto procesov.

Molekulárna biofyzika poskytuje významnú pomoc molekulárnej biológii pri štúdiu štruktúry proteínových molekúl pomocou röntgenovej difrakčnej analýzy, ktorú prvýkrát použil v roku 1930 J. Bernal. V dôsledku použitia fyzikálnych metód v kombinácii s biochemickými (enzymatickými metódami) bola odhalená molekulárna konformácia a sekvencia aminokyselín v mnohých proteínoch.

Moderné elektrónové mikroskopické štúdie, ktoré odhalili prítomnosť komplexných membránových systémov v bunkách a ich organelách, podnietili pokusy pochopiť ich molekulárnu štruktúru (pozri kapitoly 10 a 11). In vivo sa študuje chemické zloženie membrán a najmä vlastnosti ich lipidov. Zistilo sa, že tieto sú schopné nadmernej oxidácie a neenzymatických reakcií oxidácie reťazca (Yu. A. Vladimirov a F. F. Litvin, 1959; B. N. Tarusov a kol., 1960; I. I. Ivanov, 1967), čo vedie k dysfunkcii membrány. Na štúdium zloženia membrán sa začali využívať aj metódy matematického modelovania (V. Ts. Presman, 1964 - 1968; M. M. Shemyakin, 1967; Yu. A. Ovchinnikov, 1972).

Bunková biofyzika

Významnou udalosťou v dejinách biofyziky bolo sformovanie jasných predstáv o termodynamike biologických procesov v 50-tych rokoch, v dôsledku čoho sa predpoklady o možnosti nezávislej tvorby energie v živých bunkách, v rozpore s druhým termodynamickým zákonom. nakoniec zmizol. Pochopenie fungovania tohto zákona v biologických systémoch je spojené so zavedením belgického vedca I. Prigogina (1945) * do biologickej termodynamiky konceptu otvorených systémov vymieňajúcich si energiu a hmotu s vonkajším prostredím. Prigogine ukázal, že pozitívna entropia sa vytvára v živých bunkách počas pracovných procesov v súlade s druhým termodynamickým zákonom. Rovnice, ktoré zaviedol, určovali podmienky, za ktorých vzniká takzvaný stacionárny stav (predtým sa nazýval aj dynamická rovnováha), v ktorom množstvo voľnej energie (negentropia) vstupujúcej do buniek s potravou kompenzuje jej spotrebu a kladná entropia je výkon. Tento objav posilnil všeobecnú biologickú predstavu o neoddeliteľnom spojení medzi vonkajším a vnútorným prostredím buniek. Znamenalo začiatok skutočného štúdia termodynamiky živých systémov vrátane metódy modelovania (A. Burton, 1939; A. G. Pasynsky, 1967).

* (Všeobecnú teóriu otvorených systémov prvýkrát predložil L. Bertalanffy v roku 1932.)

Podľa základného princípu biotermodynamiky je nevyhnutnou podmienkou existencie života stacionárnosť vo vývoji jeho biochemických procesov, na realizáciu ktorých je potrebné koordinovať rýchlosti mnohých metabolických reakcií. Na základe novej biofyzikálnej termodynamiky sa objavil trend, ktorý vyčleňuje vonkajšie a vnútorné faktory, ktoré túto koordináciu reakcií zabezpečujú a robia ju stabilnou. V priebehu posledných dvoch desaťročí sa ukázala veľká úloha pri udržiavaní stacionárneho stavu systému inhibítorov a najmä antioxidantov (B. N. Tarusov a A. I. Zhuravlev, 1954, 1958). Zistilo sa, že spoľahlivosť stacionárneho vývoja je spojená s faktormi prostredia (teplota) a fyzikálno-chemickými vlastnosťami bunkového prostredia.

Moderné princípy biotermodynamiky umožnili podať fyzikálno-chemickú interpretáciu mechanizmu adaptácie. Podľa našich údajov k adaptácii na podmienky prostredia môže dôjsť iba vtedy, ak pri ich zmene je telo schopné nastoliť stacionárnosť vo vývoji biochemických reakcií (B.N. Tarusov, 1974). Vznikla otázka vývoja nových metód, ktoré by umožnili posúdiť stacionárny stav in vivo a predpovedať jeho možné porušenia. Veľký prínos sľubuje zavedenie kybernetických princípov samoregulačných systémov do biotermodynamiky a výskum procesov biologickej adaptácie. Ukázalo sa, že na vyriešenie problému stability ustáleného stavu je dôležité brať do úvahy takzvané rušivé faktory, medzi ktoré patria najmä neenzymatické reakcie oxidácie lipidov. V poslednej dobe sa rozširujú štúdie procesov peroxidácie v lipidových fázach živých buniek a rastu produktov aktívnych radikálov, ktoré narúšajú regulačné funkcie membrán. Zdrojom informácií o týchto procesoch je tak detekcia aktívnych peroxidových radikálov, ako aj peroxidových zlúčenín biolipidov (A. Tappel, 1965; I. I. Ivanov, 1965; E. B. Burlakova, 1967 a i.). Na detekciu radikálov sa využíva biochemiluminiscencia, ktorá vzniká v lipidoch živých buniek pri ich rekombinácii.

Na základe fyzikálno-chemických predstáv o stabilite ustáleného stavu vznikli biofyzikálne predstavy o prispôsobovaní rastlín zmenám podmienok prostredia ako porušení inhibičných antioxidačných systémov (B. N. Tarusov, Ya. E. Doskoch, B. M. Kitlaev, A. M. Agaverdiev, 1968 - 1972). To otvorilo možnosť hodnotenia takých vlastností, ako je mrazuvzdornosť a tolerancia soli, ako aj vhodné predpovede pri výbere poľnohospodárskych rastlín.

V 50. rokoch 20. storočia bola objavená ultraslabá žiara - biochemiluminiscencia množstva biologických objektov vo viditeľnej a infračervenej časti spektra (B. N. Tarusov, A. I. Žuravlev, A. I. Polivoda). To sa stalo možným výsledkom vývoja metód na registráciu superslabých svetelných tokov pomocou fotonásobičov (L. A. Kubetsky, 1934). Biochemiluminiscencia, ktorá je výsledkom biochemických reakcií prebiehajúcich v živej bunke, umožňuje posúdiť dôležité oxidačné procesy v reťazcoch prenosu elektrónov medzi enzýmami. Objav a štúdium biochemiluminiscencie má veľký teoretický a praktický význam. B. N. Tarusov a Yu. B. Kudryashov teda poznamenávajú veľkú úlohu produktov oxidácie nenasýtených mastných kyselín v mechanizme výskytu patologických stavov, ktoré sa vyvíjajú pod vplyvom ionizujúceho žiarenia, pri karcinogenéze a iných porušeniach normálnych funkcií buniek. .

V 50. rokoch 20. storočia v súvislosti s prudkým rozvojom jadrovej fyziky vznikla z biofyziky rádiobiológia, ktorá skúma biologický účinok ionizujúceho žiarenia. Výroba umelých rádioaktívnych izotopov, vytváranie termonukleárnych zbraní, atómových reaktorov a vývoj iných foriem praktického využitia atómovej energie postavili so všetkou svojou naliehavosťou problém ochrany organizmov pred škodlivými účinkami ionizujúceho žiarenia a rozvoja teoretické základy prevencie a liečby chorôb z ožiarenia. Na to bolo potrebné v prvom rade zistiť, ktoré zložky bunky a články metabolizmu sú najzraniteľnejšie.

Predmetom štúdia v biofyzike a rádiobiológii bolo objasnenie podstaty primárnych chemických reakcií, ktoré sa vyskytujú v živých substrátoch pod vplyvom energie žiarenia. Tu bolo dôležité nielen pochopiť mechanizmy tohto javu, ale aj vedieť ovplyvniť proces výmeny fyzikálnej energie za chemickú, znížiť jej koeficient „užitočného“ pôsobenia. Prácu v tomto smere iniciovalo štúdium školy N. N. Semenova (1933) v ZSSR a D. Hinshelwooda (1935) v Anglicku.

Významné miesto v rádiobiologickom výskume zaujímalo štúdium stupňa radiačnej odolnosti rôznych organizmov. Zistilo sa, že zvýšená rádiorezistencia (napríklad u púštnych hlodavcov) je spôsobená vysokou antioxidačnou aktivitou lipidov bunkových membrán (M. Chang a kol., 1964; N. K. Ogryzov a kol., 1969). Ukázalo sa, že tokoferoly, vitamín K a tio zlúčeniny hrajú dôležitú úlohu pri vytváraní antioxidačných vlastností týchto systémov (II. Ivanov et al., 1972). V posledných rokoch vzbudili veľkú pozornosť aj štúdie mechanizmov mutagenézy. Za týmto účelom sa študuje vplyv ionizujúceho žiarenia na správanie nukleových kyselín a proteínov in vitro, ako aj vo vírusoch a fágoch (A. Gustafson, 1945 - 1950).

Hlavnými úlohami biofyziky v tomto smere zostáva boj o ďalšie zvyšovanie účinnosti chemickej ochrany, hľadanie účinnejších inhibítorov a princípov inhibície.

Pokrok sa dosiahol v štúdiu excitovaných stavov biopolymérov, ktoré určujú ich vysokú chemickú aktivitu. Najúspešnejšie bolo štúdium excitovaných stavov vznikajúcich v primárnom štádiu fotobiologických procesov – fotosyntéza a videnie.

Bol teda urobený solídny príspevok k pochopeniu primárnej aktivácie molekúl rastlinných pigmentových systémov. Zistil sa veľký význam prenosu (migrácie) energie excitovaných stavov bez strát z aktivovaných pigmentov na iné substráty. Veľkú úlohu v rozvoji týchto myšlienok zohrali teoretické práce A. N. Terenina (1947 a neskôr). A. A. Krasnovsky (1949) objavil a študoval reakciu reverzibilnej fotochemickej redukcie chlorofylu a jeho analógov. Teraz panuje všeobecné presvedčenie, že v blízkej budúcnosti bude možné reprodukovať fotosyntézu v umelých podmienkach (pozri tiež kapitolu 5).

Biofyzici pokračujú v práci na odhaľovaní povahy svalovej kontrakcie a mechanizmov nervovej excitácie a vedenia (pozri kapitolu 11). Súčasný význam nadobudol aj výskum mechanizmov prechodu z excitovaného stavu do normálneho stavu. Excitovaný stav sa teraz považuje za výsledok autokatalytickej reakcie a inhibícia sa považuje za dôsledok prudkej mobilizácie inhibičnej antioxidačnej aktivity v dôsledku molekulárnych preskupení v zlúčeninách, ako je tokoferol (I. I. Ivanov, O. R. Kols, 1966; O. R. Kols, 1970).

Najdôležitejším všeobecným problémom biofyziky zostáva poznanie kvalitatívnych fyzikálnych a chemických vlastností živej hmoty. Vlastnosti ako schopnosť živých biopolymérov selektívne viazať draslík či polarizovať elektrický prúd sa nedajú zachovať ani pri najopatrnejšom odstránení z tela. Preto bunková biofyzika naďalej intenzívne rozvíja kritériá a metódy celoživotného štúdia živej hmoty.

Napriek mladosti molekulárnej biológie je pokrok, ktorý v tejto oblasti dosiahla, skutočne ohromujúci. V relatívne krátkom čase bola stanovená povaha génu a základné princípy jeho organizácie, reprodukcie a fungovania. Okrem toho sa uskutočnila nielen reprodukcia génov in vitro, ale po prvýkrát bola dokončená aj úplná syntéza samotného génu. Genetický kód bol úplne dešifrovaný a najdôležitejší biologický problém špecifickosti biosyntézy proteínov bol vyriešený. Boli identifikované a študované hlavné spôsoby a mechanizmy tvorby proteínov v bunke. Primárna štruktúra mnohých transportných RNA, špecifických adaptorových molekúl, ktoré prekladajú jazyk nukleických templátov do jazyka aminokyselinovej sekvencie syntetizovaného proteínu, bola úplne určená. Aminokyselinová sekvencia mnohých proteínov bola úplne dešifrovaná a priestorová štruktúra niektorých z nich bola stanovená. To umožnilo objasniť princíp a detaily fungovania molekúl enzýmov. Uskutočnila sa chemická syntéza jedného z enzýmov, ribonukleázy. Boli stanovené základné princípy organizácie rôznych subcelulárnych častíc, mnohých vírusov a fágov a boli odhalené hlavné spôsoby ich biogenézy v bunke. Boli objavené prístupy k pochopeniu spôsobov regulácie génovej aktivity a objasnenie regulačných mechanizmov vitálnej aktivity. Už jednoduchý zoznam týchto objavov naznačuje, že druhá polovica 20. stor. bola poznačená obrovským pokrokom v biológii, za čo vďačí predovšetkým hĺbkovému štúdiu štruktúry a funkcií biologicky dôležitých makromolekúl – nukleových kyselín a bielkovín.

Úspechy v molekulárnej biológii sa už dnes využívajú v praxi a prinášajú hmatateľné výsledky v medicíne, poľnohospodárstve a niektorých odvetviach. Niet pochýb o tom, že návratnosť tejto vedy sa bude každým dňom zvyšovať. Za hlavný výsledok však stále treba považovať, že pod vplyvom úspechov molekulárnej biológie sa posilnila dôvera v existenciu neobmedzených možností na ceste k odhaľovaniu najtajnejších tajomstiev života.

V budúcnosti sa zrejme otvoria nové spôsoby štúdia biologickej formy pohybu hmoty – biológia sa presunie z molekulárnej na atómovú úroveň. Teraz však zrejme neexistuje jediný výskumník, ktorý by dokázal reálne predpovedať vývoj molekulárnej biológie aj na najbližších 20 rokov.

Na now.nsexy.ru/ strávite nezabudnuteľný čas.

MOLEKULÁRNA BIOLÓGIA MOLEKULÁRNA BIOLÓGIA

študovanie zákl vlastnosti a prejavy života na molekulárnej úrovni. Najdôležitejšie smery v M. b. sú štúdie štrukturálnej a funkčnej organizácie genetického aparátu buniek a mechanizmu realizácie dedičnej informácie (molekulárna genetika), štúdium pier. mechanizmy interakcie vírusov s bunkami (molekulárna virológia), štúdium zákonitostí imunitných reakcií organizmu (molekulárna imunológia), štúdium výskytu rôznej kvality buniek v priebehu individuálneho vývoja organizmov a špecializácie buniek (vývoj M. b.) atď. M. b. vyšiel z biochémie a v 50. rokoch sa objavil ako samostatná veda. Narodenie M. často sa pripisuje roku 1953, kedy bola publikovaná práca J. Watsona a F. Cricka o priestorovej štruktúre molekuly DNA (tzv. dvojitá špirála), a biol. funkcia tejto molekuly bola spojená s jej chemikáliou. štruktúry (už v roku 1944 O. Avery a spol. zistili, že DNA je nositeľom dedičstiev, informácií). Vo formácii M. veľkú úlohu zohrali myšlienky a metódy klasickej genetiky, mikrobiológie, virológie, využitie výdobytkov exaktných vied – fyziky, chémie, matematiky, kryštalografie, najmä röntgenovej difrakčnej analýzy). Hlavné objekty výskumu v M.. sú vírusy vrátane bakteriofágov, bunky a subcelulárne štruktúry (jadrá, mitochondrie, ribozómy, chromozómy, bunkové membrány), ako aj makromolekuly (proteíny, nukleové kyseliny). Naib, hlavné úspechy M. - rozlúštenie štruktúry proteínov nek-ry a stanovenie spojenia medzi ich štruktúrou a funkciou (M. Peruts, J. Kendrew, F. Sanger, K. Anfinsen a i.), určenie štruktúry resp. mechanizmus biol. funkcie nukleárnych na - t a ribozómov (J. Watson, F. Crick, R. Holley a i.), dekódovanie genetick. kód (M. Nirenberg, S. Ochoa), objav reverznej transkripcie (X. Temin, D. Baltimore), mechanizmus hl. štádiá biosyntézy molekuly proteínu (F. Crick, F. Jacob, J. Mono) a nukleových kyselín (A. Kornberg, S. Ochoa), vytvorenie štruktúry vírusov a mechanizmy ich replikácie, vývoj metód genetického inžinierstva (P. Berg, V Arber, G. O. Smith, D. Nathan), syntézy génov (X. Korán) atď. Sov. vedci vlastnia formuláciu princípu matricovej syntézy biopolymérov (N. K. Koltsov), vytvorenie základov moderných. bioenergetika a mechapochémia (V. A. Engelgardt), dôkaz existencie DNA vo vyšších rastlinách (N. A. Belozersky), vytvorenie virogenet. teória nástupu rakoviny (L. A. Zilber), stanovenie nukleotidovej sekvencie v transferovej RNA (A. A. Baev), objav a štúdium informozómov (A. S. Spirin) atď. M. b. má veľký praktický význam pri rozvoji x-va (riadená a riadená zmena dedičného aparátu zvierat a rastlín na získanie vysoko produktívnych plemien a odrôd), mikrobiologický priemysel (bakteriálna syntéza biologicky aktívnych polypeptidov a bielkovín, aminokyselín atď.) a ako teoretická. základ dec. odbory medicíny (virológia, imunológia atď.). Pred M. b. sú úlohou riešiť problémy, ktoré hovoria. základy zhubného bujnenia, prevencia dedičných ochorení, objasnenie molekulárnej podstaty katalýzy, pôsobenie hormónov, toxický. a liečivých látok, znalosť mechanizmov pamäti, podstaty nervových procesov. Veľký význam má rozvoj genetického inžinierstva, ktoré umožňuje cielene prevádzkovať genetiku. aparát živočíšnych organizmov. M. b. spolu s biochémiou, biofyzikou, bioorganickou chémiou sa často spájajú do jedného všeobecného smeru – fyzikálnej a chemickej biológie.

.(Zdroj: "Biologický encyklopedický slovník." Vedúci redaktor M. S. Gilyarov; Redakčná rada: A. A. Babaev, G. G. Vinberg, G. A. Zavarzin a ďalší - 2. vyd., opravené. - M.: Sov. Encyklopédia, 1986.)

Odvetvie biológie, ktoré študuje štruktúry a procesy vlastné živým organizmom na molekulárnej úrovni. Molekulárna biológia sa snaží vysvetliť najdôležitejšie javy života (dedičnosť, premenlivosť, rast, vývoj, pohyb, metabolizmus a energia, citlivosť, imunitu atď.) štruktúrou, vlastnosťami a interakciami chemických látok, ktoré tvoria organizmy. V každom organizme v každom okamihu jeho existencie prebieha obrovské množstvo biochemických reakcií, na ktorých sa zúčastňujú molekuly veľké i malé, jednoduché aj zložité, organické a anorganické. Všetky tieto reakcie sú prísne nariadené a v závislosti od podmienok a potrieb organizmu podliehajú ladeniu a regulácii. Rozhodujúcu úlohu v organizácii týchto procesov majú dve triedy veľkých molekúl - bielkoviny a nukleových kyselín. Tieto biopolyméry slúžia ako hlavný predmet štúdia v molekulárnej biológii.
Molekulárna biológia sa od začiatku rozvíjala ako vedný odbor súvisiaci predovšetkým s biochémiou a biofyzikou, ale aj genetikou, mikrobiológiou a virológiou. V 30-40 rokoch. 20. storočie na stanovenie priestorovej štruktúry najdôležitejších proteínov sa začala používať röntgenová difrakčná analýza, ktorá následne zohrala rozhodujúcu úlohu pri stanovení štruktúry DNA. Zavedenie metód a myšlienok fyziky a chémie do biológie v týchto rokoch položilo základ pre rozvoj „molekulárneho“ smeru. Jeho budúce úspechy v mnohom predurčili záujem fyzikov a chemikov o tento problém dedičnosť. V roku 1944 vyšla kniha jedného zo zakladateľov kvantovej mechaniky E. Schrödingera „Čo je život? Z pohľadu fyzika“, ktorý obsahoval súhrn základov genetiky. Táto práca bola mnohými predstaviteľmi exaktných vied vnímaná ako výzva sústrediť úsilie na vyriešenie hádanky „podstaty dedičnosti“.
Po 9 rokoch tento problém vyriešili J. Watson a F. Crick. V čase uverejnenia ich článku (apríl 1953), v ktorom bol navrhnutý model molekuly DNA (tzv. dvojitá špirála), je zvykom pripisovať zrod molekulárnej biológii. Watson-Crickov model živo vyjadril hlavný smer novej vedy: biologické funkcie makromolekuly možno vysvetliť jej štruktúrou (porov. Deoxyribonukleové kyseliny). Zároveň bola molekulárna úroveň (dvojvláknová DNA) logicky spojená so subcelulárnou úrovňou (replikácia chromozómov), mobilné ( mitóza, meióza) a organizmickej (dedičnosť vlastností).
S podobným prístupom sa stretli aj staršie práce. Ešte v roku 1927 N.K. Kolcov vyjadrili hypotézu o "dedičných molekulách" schopných reprodukovať matricovú syntézu a V.A. Engelhardtovi sa v roku 1939 podarilo spojiť štruktúru svalových bielkovín s ich úlohou pri svalovej kontrakcii. Až po „dvojzávitnici“ sa však začal prudký rozvoj molekulárnej biológie, ktorá sa stala lídrom prírodných vied. Okrem mnohých špecifických úspechov (dešifrovanie genetický kód, odhalenie mechanizmov biosyntézy proteínov, priestorovej štruktúry enzýmov a iných proteínov, štruktúry a úlohy biologických membrán v bunkových procesoch atď.), molekulárna biológia odhalila niektoré všeobecné princípy, na základe ktorých existuje široká škála biologických procesy. Komplementarita interagujúcich molekúl (ich komplementarita, vzájomná korešpondencia ako „kľúč a zámok“), ktorá vedie k vytvoreniu nekovalentných chemických väzieb medzi nimi, je teda základom procesov, ktoré si vyžadujú biologickú špecifickosť (selektivitu, „rozpoznanie“). od syntézy DNA a proteínov a končiac tvorbou komplexov medzi enzýmom a substrátom, protilátkou a antigénom, samoskladaním vírusových častíc a cytoskeletu. Podobne princíp syntézy matrice bunky nevyužívajú raz, ale v rôznych štádiách implementácie genetickej informácie.
V apríli 2003 vedci z celého sveta oslávili polstoročné výročie „dvojitej špirály“ a molekulárnej biológie. V našej krajine položili základy rozvoja tohto smeru diela akademikov V.A. Engelhardt (1894-1984), A.N. Belozersky (1905-1972), A.A. Baeva (1903/04-1994).

.(Zdroj: "Biology. Modern Illustrated Encyclopedia." Šéfredaktor A.P. Gorkin; M.: Rosmen, 2006.)

Pozrite sa, čo je „MOLEKULÁRNA BIOLOGIA“ v iných slovníkoch:

Skúma základné vlastnosti a prejavy života na molekulárnej úrovni. Zisťuje, ako a do akej miery je rast a vývoj organizmov, ukladanie a prenos dedičných informácií, premena energie v živých bunkách a iné javy spôsobené ... Veľký encyklopedický slovník

Moderná encyklopédia

MOLEKULÁRNA BIOLÓGIA, biologické štúdium štruktúry a funkcie MOLEKÚL, ktoré tvoria živé organizmy. Medzi hlavné oblasti štúdia patria fyzikálne a chemické vlastnosti proteínov a NUKLEOVÝCH KYSELÍN, ako je DNA. pozri tiež… … Vedecko-technický encyklopedický slovník

Sekcia biológie, ktorá skúma základné vlastnosti a prejavy života na molekulárnej úrovni. Zisťuje, ako a do akej miery rast a vývoj organizmov, ukladanie a prenos dedičných informácií, premena energie v živých bunkách a ... ... Mikrobiologický slovník

molekulárna biológia- — Témy biotechnológie EN molekulárna biológia … Technická príručka prekladateľa

Molekulárna biológia- MOLEKULÁRNA BIOLÓGIA, skúma základné vlastnosti a prejavy života na molekulárnej úrovni. Zisťuje, ako a do akej miery rast a vývoj organizmov, ukladanie a prenos dedičných informácií, premena energie v živých bunkách a ... ... Ilustrovaný encyklopedický slovník

Tento výraz má iné významy, pozri Molekulárna biológia (časopis). Molekulárna biológia je komplex biologických vied, ktorý študuje mechanizmy ukladania, prenosu a implementácie genetickej informácie, štruktúru a funkcie ... ... Wikipedia

Veda, ktorá si kladie za úlohu poznanie podstaty životných javov štúdiom biologických objektov a systémov na úrovni približujúcej sa molekulárnej úrovni a v niektorých prípadoch dosahujúcej túto hranicu. Konečným cieľom tohto je…… Veľká sovietska encyklopédia

Študuje javy života na úrovni makromolekúl (ch. arr. proteíny a nukleové kyseliny) v bezbunkových štruktúrach (ribozómy a pod.), vo vírusoch a tiež v bunkách. Účel M.. ktorým sa stanovuje úloha a mechanizmus fungovania týchto makromolekúl na základe ... ... Chemická encyklopédia

Skúma základné vlastnosti a prejavy života na molekulárnej úrovni. Zisťuje, ako a do akej miery rast a vývoj organizmov, ukladanie a prenos dedičných informácií, premena energie v živých bunkách a iné javy ... ... encyklopedický slovník

Dá sa povedať, že molekulárna biológia študuje prejavy života na neživých štruktúrach alebo systémoch s elementárnymi znakmi vitálnej aktivity (ktorými môžu byť jednotlivé biologické makromolekuly, ich komplexy alebo organely), pričom študuje, ako sa kľúčové procesy, ktoré charakterizujú živú hmotu, realizujú prostredníctvom chemických látok. interakcie a transformácie.

Oddelenie molekulárnej biológie od biochémie do samostatnej vednej oblasti je diktované skutočnosťou, že jej hlavnou úlohou je študovať štruktúru a vlastnosti biologických makromolekúl zapojených do rôznych procesov, objasniť mechanizmy ich interakcie. Biochémia sa na druhej strane zaoberá štúdiom skutočných procesov životnej činnosti, zákonitostí ich priebehu v živom organizme a premien molekúl, ktoré tieto procesy sprevádzajú. Molekulárna biológia sa v konečnom dôsledku snaží odpovedať na otázku, prečo k tomu či onomu procesu dochádza, zatiaľ čo biochémia odpovedá na otázky, kde a ako z hľadiska chémie k predmetnému procesu dochádza.

Príbeh

Molekulárna biológia ako samostatná oblasť biochémie sa začala formovať v tridsiatych rokoch minulého storočia. Práve vtedy pre hlbšie pochopenie fenoménu života vyvstala potreba cieleného štúdia na molekulárnej úrovni procesov ukladania a prenosu dedičných informácií v živých organizmoch. Potom bola definovaná úloha molekulárnej biológie pri štúdiu štruktúry, vlastností a interakcie nukleových kyselín a proteínov. Termín „molekulárna biológia“ prvýkrát použil anglický vedec William Astbury v kontexte výskumu súvisiaceho s objasnením vzťahu medzi molekulárnou štruktúrou a fyzikálnymi a biologickými vlastnosťami fibrilárnych proteínov, ako je kolagén, krvný fibrín alebo svalové kontraktilné proteíny. .

V počiatkoch molekulárnej biológie bola RNA považovaná za súčasť rastlín a húb, zatiaľ čo DNA bola považovaná za typickú zložku živočíšnych buniek. Prvým výskumníkom, ktorý dokázal, že DNA sa nachádza v rastlinách, bol Andrey Nikolaevič Belozersky, ktorý v roku 1935 izoloval DNA hrachu. Tento objav potvrdil skutočnosť, že DNA je univerzálna nukleová kyselina prítomná v rastlinných a živočíšnych bunkách.

Veľkým úspechom bolo vytvorenie priameho kauzálneho vzťahu medzi génmi a proteínmi, ktoré vytvorili George Beadle a Edward Tatum. Vo svojich experimentoch odhalili bunky neurospór ( Neurosporacrassa) Expozícia röntgenovým žiarením, ktorá spôsobila mutácie. Získané výsledky ukázali, že to viedlo k zmene vlastností špecifických enzýmov.

V roku 1940 Albert Claude izoloval z cytoplazmy živočíšnych buniek granule obsahujúce cytoplazmatickú RNA, ktoré boli menšie ako mitochondrie. Nazval ich mikrozómy. Následne pri štúdiu štruktúry a vlastností izolovaných častíc bola stanovená ich základná úloha v procese biosyntézy proteínov. V roku 1958 sa na prvom sympóziu venovanom týmto časticiam rozhodlo nazvať tieto častice ribozómy.

Ďalším dôležitým krokom vo vývoji molekulárnej biológie boli publikované údaje experimentu Oswalda Averyho, Colina MacLeoda a MacLeana McCarthyho v roku 1944, ktorý ukázal, že DNA je príčinou bakteriálnej transformácie. Bol to prvý experimentálny dôkaz o úlohe DNA pri prenose dedičných informácií, čím sa vyvrátila skoršia myšlienka proteínovej povahy génov.

Začiatkom 50. rokov Frederick Sanger ukázal, že proteínový reťazec je jedinečná sekvencia aminokyselinových zvyškov. Koncom 50. rokov 20. storočia Max Perutz a John Kendrew rozlúštili priestorovú štruktúru prvých proteínov. Už v roku 2000 boli známe státisíce prirodzených sekvencií aminokyselín a tisíce priestorových štruktúr proteínov.

Približne v rovnakom čase mu výskum Erwina Chargaffa umožnil sformulovať pravidlá popisujúce pomer dusíkatých báz v DNA (pravidlá hovoria, že bez ohľadu na druhové rozdiely v DNA sa množstvo guanínu rovná množstvu cytozínu a množstvo adenínu sa rovná množstvu themin), čo neskôr pomohlo k najväčšiemu prelomu v molekulárnej biológii a k ​​jednému z najväčších objavov v biológii vôbec.

K tejto udalosti došlo v roku 1953, keď James Watson a Francis Crick na základe práce Rosalind Franklinovej a Mauricea Wilkinsa Röntgenová difrakčná analýza DNA, vytvorila dvojvláknovú štruktúru molekuly DNA. Tento objav umožnil odpovedať na základnú otázku o schopnosti nositeľa dedičnej informácie samoreprodukovať sa a pochopiť mechanizmus prenosu takejto informácie. Tí istí vedci sformulovali princíp komplementarity dusíkatých báz, ktorý má kľúčový význam pre pochopenie mechanizmu tvorby supramolekulárnych štruktúr. Tento princíp, ktorý sa dnes používa na popis všetkých molekulových komplexov, umožňuje popísať a predpovedať podmienky pre vznik slabých (nevalentných) medzimolekulových interakcií, ktoré podmieňujú možnosť vzniku sekundárnych, terciárnych atď. štruktúry makromolekúl, samousporiadanie supramolekulových biologických systémov, ktoré určujú takú širokú škálu molekulárnych štruktúr a ich funkčných súborov. Potom v roku 1953 vyšiel vedecký časopis Journal of Molecular Biology. Na jej čele stál John Kendrew, ktorého oblasťou vedeckého záujmu bolo štúdium štruktúry globulárnych proteínov (Nobelova cena v roku 1962, spolu s Maxom Perutzom). Podobný ruskojazyčný časopis s názvom Molecular Biology založil v ZSSR V. A. Engelhardt v roku 1966.

V roku 1958 Francis Crick sformuloval tzv. centrálna dogma molekulárnej biológie: myšlienka nezvratnosti toku genetickej informácie z DNA cez RNA do proteínov podľa schémy DNA → DNA (replikácia, vytvorenie kópie DNA), DNA → RNA (transkripcia, kopírovanie génov), RNA → proteín (preklad, dekódovanie informácií o štruktúre proteínov). Táto dogma bola trochu opravená v roku 1970, berúc do úvahy nahromadené poznatky, pretože fenomén reverznej transkripcie objavili nezávisle Howard Temin a David Baltimore: bol objavený enzým - reverzná transkriptáza, ktorá je zodpovedná za implementáciu reverznej transkripcie - tzv. tvorba dvojvláknovej DNA na templáte jednovláknovej RNA, ktorá sa vyskytuje u onkogénnych vírusov. Treba poznamenať, že základom molekulárnej biológie stále zostáva striktná nevyhnutnosť toku genetickej informácie z nukleových kyselín do proteínov.

V roku 1957 Alexander Sergejevič Spirin spolu s Andrejom Nikolaevičom Belozerským ukázali, že napriek významným rozdielom v zložení nukleotidov DNA z rôznych organizmov je zloženie celkovej RNA podobné. Na základe týchto údajov dospeli k senzačnému záveru, že celková RNA bunky nemôže pôsobiť ako nosič genetickej informácie z DNA do proteínov, keďže jej svojim zložením nezodpovedá. Zároveň si všimli, že existuje menšia frakcia RNA, ktorá svojim nukleotidovým zložením plne zodpovedá DNA a ktorá môže byť skutočným nosičom genetickej informácie z DNA do proteínov. Vďaka tomu predpovedali existenciu relatívne malých molekúl RNA, ktoré sú štruktúrou analogické s jednotlivými úsekmi DNA a pôsobia ako sprostredkovatelia pri prenose genetickej informácie obsiahnutej v DNA do ribozómu, kde sa pomocou tejto informácie syntetizujú molekuly proteínov. V roku 1961 (S. Brenner, F. Jacob, M. Meselson na jednej strane a F. Gros, Francois Jacob a Jacques Monod ako prví experimentálne potvrdili existenciu takýchto molekúl – informačnej (matrix) RNA. vyvinuli koncepciu a model funkčných jednotiek DNA - operónu, ktorý umožnil exaktne vysvetliť, ako prebieha regulácia génovej expresie u prokaryotov Štúdium mechanizmov biosyntézy bielkovín a princípov štruktúrnej organizácie a prevádzka molekulárnych strojov – ribozómov – umožnila sformulovať postulát opisujúci pohyb genetickej informácie, nazývaný centrálna dogma molekulárnej biológie: DNA – mRNA je proteín.

V roku 1961 a počas niekoľkých nasledujúcich rokov Heinrich Mattei a Marshall Nirenberg a potom Har Korana a Robert Holly vykonali niekoľko prác na rozlúštenie genetického kódu, v dôsledku čoho sa vytvoril priamy vzťah medzi štruktúrou DNA a syntetizovanými proteínmi. a nukleotidová sekvencia, ktorá určuje sadu aminokyselín v proteíne. Získali sa aj údaje o univerzálnosti genetického kódu. Objavy boli v roku 1968 ocenené Nobelovou cenou.

Pre rozvoj moderných predstáv o funkciách RNA, objav nekódujúcej RNA, uskutočnený na základe výsledkov práce Alexandra Sergejeviča Spirina spolu s Andrejom Nikolajevičom Belozerským v roku 1958, Charles Brenner so spoluautormi a Saulom Spiegelman v roku 1961 bol rozhodujúci. Tento typ RNA tvorí väčšinu bunkovej RNA. Ribozomálne RNA sú primárne nekódujúce.

Spôsoby kultivácie a hybridizácie živočíšnych buniek prešli vážnym vývojom. V roku 1963 François Jacob a Sydney Brenner sformulovali myšlienku replikónu, sekvencie prirodzene sa replikujúcich génov, ktorá vysvetľuje dôležité aspekty regulácie replikácie génov.

V roku 1967 sa v laboratóriu A. S. Spirina po prvý raz preukázalo, že tvar kompaktne poskladanej RNA určuje morfológiu ribozomálnej častice.

V roku 1968 sa podaril významný zásadný objav. Okazaki, ktorá pri štúdiu procesu replikácie objavila fragmenty DNA zaostávajúceho vlákna, pomenovala po nej fragmenty Okazaki, objasnila mechanizmus replikácie DNA.

V roku 1970 Howard Temin a David Baltimore nezávisle od seba urobili významný objav: bol objavený enzým – reverzná transkriptáza, ktorá je zodpovedná za realizáciu reverznej transkripcie – tvorba dvojvláknovej DNA na templáte jednovláknovej RNA, ku ktorej dochádza v r. onkogénne vírusy obsahujúce RNA.

Ďalším významným úspechom molekulárnej biológie bolo vysvetlenie mechanizmu mutácií na molekulárnej úrovni. V dôsledku série štúdií boli stanovené hlavné typy mutácií: duplikácie, inverzie, delécie, translokácie a transpozície. To umožnilo uvažovať o evolučných zmenách z pohľadu génových procesov a umožnilo rozvinúť teóriu molekulárnych hodín, ktorá sa využíva vo fylogenéze.

Začiatkom 70. rokov 20. storočia boli sformulované základné princípy fungovania nukleových kyselín a bielkovín v živom organizme. Zistilo sa, že proteíny a nukleové kyseliny v tele sa syntetizujú podľa matricového mechanizmu, molekula matrice nesie zašifrovanú informáciu o sekvencii aminokyselín (v proteíne) alebo nukleotidov (v nukleovej kyseline). Pri replikácii (zdvojnásobenie DNA) alebo transkripcii (syntéza mRNA) slúži DNA ako taký templát, pri translácii (syntéza bielkovín) alebo reverznej transkripcii - mRNA.

Vytvorili sa tak teoretické predpoklady pre rozvoj aplikovaných oblastí molekulárnej biológie, najmä genetického inžinierstva. V roku 1972 Paul Berg, Herbert Bauer a Stanley Cohen vyvinuli technológiu molekulárneho klonovania. Potom boli prví, ktorí získali rekombinantnú DNA in vitro. Tieto vynikajúce experimenty položili základy genetického inžinierstva a tento rok sa považuje za dátum narodenia tohto vedeckého smeru.

V roku 1977 Frederick Sanger a nezávisle Allan Maxum a Walter Gilbert vyvinuli rôzne metódy na určenie primárnej štruktúry (sekvenovania) DNA. Sangerova metóda, takzvaná metóda ukončenia reťazca, je základom modernej metódy sekvenovania. Princíp sekvenovania je založený na použití značených báz, ktoré pôsobia ako terminátory v cyklickej sekvenačnej reakcii. Táto metóda sa rozšírila vďaka schopnosti rýchlo vykonávať analýzu.

1976 – Frederick. Sanger dešifroval nukleotidovú sekvenciu DNA fága φΧ174 s dĺžkou 5375 nukleotidových párov.

1981 – Kosáčikovitá anémia sa stala prvou genetickou chorobou diagnostikovanou analýzou DNA.

1982-1983 objav katalytickej funkcie RNA v amerických laboratóriách T. Checka a S. Altmana zmenil doterajšie predstavy o výlučnej úlohe proteínov. Analogicky s katalytickými proteínmi - enzýmami sa katalytické RNA nazývali ribozýmy.

1987 Keri Mullez objavil polymerázovú reťazovú reakciu, vďaka ktorej je možné umelo výrazne zvýšiť počet molekúl DNA v roztoku pre ďalšiu prácu. Dnes je to jedna z najvýznamnejších metód molekulárnej biológie využívaná pri štúdiu dedičných a vírusových ochorení, pri štúdiu génov a pri genetickej identifikácii a príbuzenstve atď.

V roku 1990 v rovnakom čase tri skupiny vedcov publikovali metódu, ktorá umožnila v laboratóriu rýchlo získať syntetické funkčne aktívne RNA (umelé ribozýmy alebo molekuly, ktoré interagujú s rôznymi ligandami – aptamérmi). Táto metóda sa nazýva „evolúcia in vitro“. A čoskoro na to, v rokoch 1991-1993 v laboratóriu A.B. Chetverinovi bola experimentálne preukázaná možnosť existencie, rastu a amplifikácie molekúl RNA vo forme kolónií na pevnom médiu.

V roku 1998 takmer súčasne Craig Mello a Andrew Fire opísali mechanizmus pozorovaný skôr pri génových experimentoch s baktériami a kvetmi. RNA interferencia, v ktorom malá dvojvláknová molekula RNA vedie k špecifickému potlačeniu génovej expresie.

Objav mechanizmu interferencie RNA má veľký praktický význam pre modernú molekulárnu biológiu. Tento jav je široko používaný vo vedeckých experimentoch ako nástroj na „vypnutie“, teda potlačenie prejavu jednotlivých génov. Zvlášť zaujímavá je skutočnosť, že táto metóda umožňuje reverzibilné (dočasné) potlačenie aktivity študovaných génov. Prebieha výskum zameraný na aplikáciu tohto fenoménu na liečbu vírusových, neoplastických, degeneratívnych a metabolických ochorení. Treba poznamenať, že v roku 2002 boli objavené mutanty vírusov detskej obrny, ktoré sa dokážu vyhnúť interferencii RNA, takže vývoj skutočne účinných liečebných postupov založených na tomto fenoméne si vyžaduje viac starostlivej práce.

V rokoch 1999-2001 niekoľko skupín výskumníkov určilo štruktúru bakteriálneho ribozómu s rozlíšením 5,5 až 2,4 angstromov.

Predmet

Úspechy molekulárnej biológie v poznaní živej prírody možno len ťažko preceňovať. Veľký úspech bol dosiahnutý vďaka úspešnému konceptu výskumu: komplexné biologické procesy sú posudzované z hľadiska jednotlivých molekulárnych systémov, čo umožňuje aplikovať presné fyzikálno-chemické výskumné metódy. Do tejto oblasti vedy pritiahla aj mnoho skvelých ľudí z príbuzných oblastí: chémie, fyziky, cytológie, virológie, čo malo tiež priaznivý vplyv na rozsah a rýchlosť rozvoja vedeckých poznatkov v tejto oblasti. Takéto významné objavy, ako je určenie štruktúry DNA, dešifrovanie genetického kódu a umelo riadená modifikácia genómu, umožnili oveľa hlbšie pochopiť špecifiká vývojových procesov organizmov a úspešne vyriešiť množstvo dôležitých základných a aplikované vedecké, medicínske a sociálne problémy, ktoré sa ešte nedávno považovali za neriešiteľné.

Predmetom štúdia molekulárnej biológie sú najmä proteíny, nukleové kyseliny a na nich založené molekulárne komplexy (molekulové stroje) a procesy, na ktorých sa podieľajú.

Nukleové kyseliny sú lineárne polyméry pozostávajúce z nukleotidových jednotiek (zlúčeniny päťčlenného cukru s fosfátovou skupinou na piatom atóme cyklu a jednou zo štyroch dusíkatých báz) vzájomne prepojené esterovou väzbou fosfátových skupín. Nukleová kyselina je teda pentózofosfátový polymér s dusíkatými bázami ako bočnými substituentmi. Chemické zloženie reťazca RNA sa líši od DNA v tom, že prvý pozostáva z päťčlenného ribózového sacharidového cyklu, zatiaľ čo druhý pozostáva z dehydroxylovaného derivátu ribózy, deoxyribózy. Zároveň sa tieto molekuly dramaticky líšia v priestore, pretože RNA je flexibilná jednovláknová molekula, zatiaľ čo DNA je dvojvláknová molekula.

Proteíny sú lineárne polyméry, čo sú reťazce alfa-aminokyselín vzájomne prepojených peptidovou väzbou, odtiaľ pochádza aj ich druhý názov – polypeptidy. Zloženie prírodných proteínov zahŕňa mnoho rôznych aminokyselinových jednotiek - u ľudí až 20 -, čo určuje širokú škálu funkčných vlastností týchto molekúl. Tieto alebo tie proteíny sa zúčastňujú takmer každého procesu v tele a plnia mnoho úloh: hrajú úlohu bunkového stavebného materiálu, zabezpečujú transport látok a iónov, katalyzujú chemické reakcie – tento zoznam je veľmi dlhý. Proteíny tvoria stabilné molekulárne konformácie rôznych úrovní organizácie (sekundárne a terciárne štruktúry) a molekulárne komplexy, čo ďalej rozširuje ich funkčnosť. Tieto molekuly môžu mať vysokú špecifickosť na vykonávanie určitých úloh v dôsledku tvorby komplexnej priestorovej globulárnej štruktúry. Široká škála proteínov zabezpečuje neustály záujem vedcov o tento druh molekúl.

Moderné myšlienky o predmete molekulárnej biológie sú založené na zovšeobecnení, ktoré prvýkrát predložil Francis Crick v roku 1958 ako ústrednú dogmu molekulárnej biológie. Jeho podstatou bolo tvrdenie, že genetická informácia v živých organizmoch prechádza striktne definovanými štádiami implementácie: kopírovaním z DNA do DNA pri vstupe do dedičstva, z DNA do RNA a potom z RNA na proteín a spätný prechod nie je možný. Toto tvrdenie bolo pravdivé len čiastočne, preto bola centrálna dogma následne opravená s ohľadom na novoobjavené údaje.

V súčasnosti existuje niekoľko spôsobov implementácie genetického materiálu, ktoré predstavujú rôzne sekvencie pre implementáciu troch typov existencie genetickej informácie: DNA, RNA a proteínu. V deviatich možných spôsoboch realizácie sa rozlišujú tri skupiny: ide o tri všeobecné premeny (všeobecné), ktoré sa bežne uskutočňujú vo väčšine živých organizmov; tri špeciálne transformácie (špeciálne), uskutočnené v niektorých vírusoch alebo v špeciálnych laboratórnych podmienkach; tri neznáme transformácie (neznáme), ktorých realizácia sa považuje za nemožnú.

Bežné transformácie zahŕňajú nasledujúce spôsoby implementácie genetického kódu: DNA→DNA (replikácia), DNA→RNA (transkripcia), RNA→proteín (translácia).

Na uskutočnenie prenosu dedičných vlastností musia rodičia odovzdať svojim potomkom plnohodnotnú molekulu DNA. Proces, pri ktorom je možné syntetizovať presnú kópiu pôvodnej DNA, a teda preniesť genetický materiál, sa nazýva replikácia. Vykonávajú ho špeciálne proteíny, ktoré molekulu rozpletú (narovnajú jej rez), rozvinú dvojitú špirálu a pomocou DNA polymerázy vytvoria presnú kópiu pôvodnej molekuly DNA.

Na zabezpečenie života bunky sa musí neustále odvolávať na genetický kód vložený do dvojitej špirály DNA. Táto molekula je však príliš veľká a nemotorná na to, aby sa dala použiť ako priamy zdroj genetického materiálu na nepretržitú syntézu bielkovín. Preto v priebehu implementácie informácií vložených do DNA existuje medzistupeň: syntéza mRNA, čo je malá jednovláknová molekula komplementárna s určitým segmentom DNA kódujúcim určitý proteín. Transkripčný proces zabezpečuje RNA polymeráza a transkripčné faktory. Výsledná molekula môže byť potom ľahko doručená do časti bunky zodpovednej za syntézu proteínov – ribozómu.

Po vstupe RNA do ribozómu začína konečná fáza realizácie genetickej informácie. V tomto prípade ribozóm číta genetický kód z mRNA v tripletoch nazývaných kodóny a na základe prijatých informácií syntetizuje zodpovedajúci proteín.

Pri špeciálnych transformáciách sa genetický kód realizuje podľa schémy RNA → RNA (replikácia), RNA → DNA (reverzná transkripcia), DNA → proteín (priama translácia). Replikácia tohto typu sa realizuje v mnohých vírusoch, kde ju uskutočňuje enzým RNA-dependentná RNA polymeráza. Podobné enzýmy sa nachádzajú aj v eukaryotických bunkách, kde sú spojené s procesom umlčania RNA. Reverzná transkripcia bola nájdená v retrovírusoch, kde sa uskutočňuje pomocou enzýmu reverzná transkriptáza, a v niektorých prípadoch v eukaryotických bunkách, napríklad počas telomerickej syntézy. Živý prenos sa uskutočňuje iba v umelých podmienkach v izolovanom systéme mimo bunky.

Ktorýkoľvek z troch možných prechodov genetickej informácie z proteínu na proteín, RNA alebo DNA sa považuje za nemožný. Prípad pôsobenia priónov na proteíny, v dôsledku čoho vzniká podobný prión, by sa dal podmienečne pripísať typu realizácie genetickej informácie proteín → proteín. Formálne to však nie je, pretože neovplyvňuje sekvenciu aminokyselín v proteíne.

História vzniku pojmu „centrálna dogma“ je zvedavá. Keďže slovo dogma vo všeobecnosti znamená tvrdenie, ktoré nepodlieha pochybnostiam, a slovo samo osebe má jasnú náboženskú konotáciu, voliť ho ako opis vedeckého faktu nie je celkom legitímne. Podľa samotného Francisa Cricka to bola jeho chyba. Chcel dať predloženej teórii väčší význam, odlíšiť ju od pozadia iných teórií a hypotéz; prečo sa rozhodol použiť toto majestátne, podľa neho slovo, nerozumejúc jeho pravému významu. Názov sa však zasekol.

Molekulárna biológia dnes

Rýchly rozvoj molekulárnej biológie, neustály záujem o úspechy v tejto oblasti zo strany spoločnosti a objektívny význam výskumu viedli k vzniku veľkého počtu veľkých výskumných centier molekulárnej biológie po celom svete. Z najväčších treba spomenúť: laboratórium molekulárnej biológie v Cambridge, Kráľovský inštitút v Londýne - vo Veľkej Británii; ústavy molekulárnej biológie v Paríži, Marseille a Štrasburgu, Pasteurov inštitút - vo Francúzsku; katedry molekulárnej biológie na Harvardskej univerzite a Massachusetts Institute of Technology, University of Berkeley, California Institute of Technology, Rockefeller University, Institute of Public Health v Bethesde – v USA; inštitúty Maxa Plancka, univerzity v Göttingene a Mníchove, Centrálny inštitút pre molekulárnu biológiu v Berlíne, inštitúty v Jene a Halle – v Nemecku; Karolinska Institute v Štokholme, Švédsko.

V Rusku sú poprednými centrami v tejto oblasti Ústav molekulárnej biológie. Ústav molekulárnej genetiky RAS, Ústav génovej biológie RAS, Ústav fyzikálno-chemickej biológie pomenovaný po V.A. Moskovská štátna univerzita A. N. Belozerského. Biochemický ústav M. V. Lomonosova. A.N. Bach RAS a Institute of Protein RAS v Pushchino.

Oblasť záujmu molekulárnych biológov dnes pokrýva široké spektrum základných vedeckých otázok. Tak ako predtým, vedúcu úlohu zohráva štúdium štruktúry nukleových kyselín a biosyntézy proteínov, štúdium štruktúry a funkcií rôznych intracelulárnych štruktúr a bunkových povrchov. Dôležitými oblasťami výskumu je aj štúdium mechanizmov príjmu a prenosu signálu, molekulárnych mechanizmov transportu zlúčenín v rámci bunky a tiež z bunky do vonkajšieho prostredia a späť. Jedným z hlavných smerov vedeckého výskumu v oblasti aplikovanej molekulárnej biológie je problém vzniku a vývoja nádorov. Veľmi dôležitou oblasťou, ktorej sa venuje sekcia molekulárnej biológie – molekulárnej genetiky, je aj štúdium molekulárnej podstaty výskytu dedičných chorôb a vírusových chorôb, ako je AIDS, ako aj vývoj metód ich vzniku. prevencia a prípadne liečba na úrovni génov. Objavy a vývoj molekulárnych biológov v súdnom lekárstve našli široké uplatnenie. Skutočnú revolúciu v oblasti osobnej identifikácie urobili v 80. rokoch vedci z Ruska, USA a Veľkej Británie vďaka vývoju a implementácii metódy „genomic fingerprinting“ – identifikácie DNA v každodennej praxi. Výskum v tejto oblasti neprestáva dodnes, moderné metódy umožňujú založiť človeka s pravdepodobnosťou chyby jednej miliardtiny percenta. Už teraz sa aktívne rozvíja projekt genetického pasu, ktorý podľa očakávania výrazne zníži mieru kriminality.

Metodológia

Dnes má molekulárna biológia rozsiahly arzenál metód na riešenie najpokročilejších a najzložitejších problémov, ktorým vedci čelia.

Jedna z najbežnejších metód v molekulárnej biológii je gélová elektroforéza, ktorý rieši problém oddeľovania zmesi makromolekúl podľa veľkosti alebo náboja. Takmer vždy sa po oddelení makromolekúl v géli používa blotting, metóda, ktorá umožňuje preniesť makromolekuly z gélu (sorb) na povrch membrány pre uľahčenie ďalšej práce s nimi, najmä hybridizácie. Hybridizácia – tvorba hybridnej DNA z dvoch reťazcov rôznej povahy – metóda, ktorá hrá dôležitú úlohu v základnom výskume. Používa sa na určenie komplementárne segmentov v rôznych DNA (DNA rôznych druhov), slúži na hľadanie nových génov, bola s jeho pomocou objavená RNA interferencia a jej princíp tvoril základ genómového fingerprintingu.

Významnú úlohu v modernej praxi molekulárno-biologického výskumu zohráva metóda sekvenovania - stanovenie sekvencie nukleotidov v nukleových kyselinách a aminokyselín v proteínoch.

Modernú molekulárnu biológiu si nemožno predstaviť bez metódy polymerázovej reťazovej reakcie (PCR). Vďaka tejto metóde sa uskutočňuje zvýšenie počtu (amplifikácie) kópií určitej sekvencie DNA, aby sa z jednej molekuly získalo dostatočné množstvo látky na ďalšiu prácu s ňou. Podobný výsledok sa dosahuje technológiou molekulárneho klonovania, pri ktorej sa potrebná nukleotidová sekvencia zavedie do DNA baktérií (živých systémov), po čom pomnoženie baktérií vedie k požadovanému výsledku. Tento prístup je technicky oveľa komplikovanejší, ale umožňuje súčasne získať výsledok expresie študovanej nukleotidovej sekvencie.

V molekulárno-biologických štúdiách sú tiež široko používané ultracentrifugačné metódy (na separáciu makromolekúl (veľké množstvá), buniek, organel), elektrónová a fluorescenčná mikroskopia, spektrofotometrické metódy, röntgenová difrakčná analýza, autorádiografia atď.

Moderné vybavenie umožňuje vďaka technologickému pokroku a vedeckému výskumu v oblasti chémie, fyziky, biológie a informatiky izolovať, študovať a meniť jednotlivé gény a procesy, na ktorých sa podieľajú.

V krátkosti pripomeniem tzv centrálna dogma molekulárnej biológie, ktorú pôvodne sformuloval Francis Crick. Vo všeobecnosti uvádza, že genetická informácia sa pri implementácii prenáša z nukleových kyselín do proteínov, ale nie naopak. Presnejšie povedané, je možné preniesť DNA → DNA ( replikácie), DNA → RNA ( prepis) a RNA → proteín ( vysielať). Existujú aj oveľa menej bežné spôsoby, ktoré sú charakteristické pre niektoré vírusy: RNA → DNA ( reverzná transkripcia) a RNA → RNA ( replikácia RNA). Ešte pripomeniem, že proteíny sa skladajú z aminokyselinových zvyškov, ktorých poradie je zakódované v genetickom kóde organizmu: tri nukleotidy (tzv. kodón, alebo trojčatá) kóduje jednu aminokyselinu a tá istá aminokyselina môže byť kódovaná niekoľkými kodónmi.

V druhej polovici 20. storočia boli vyvinuté technológie rekombinantná DNA(čiže metódy manipulácie s DNA, ktoré umožňujú rôznymi spôsobmi meniť sekvenciu a zloženie nukleotidov v molekule). Práve na ich základe sa dodnes vyvíjajú všetky molekulárno-biologické metódy, hoci sa ideovo aj technologicky stali oveľa zložitejšími. Práve molekulárna biológia spôsobila za posledné polstoročie taký prudký nárast množstva biologických informácií.

Budem hovoriť o metódach manipulácie a štúdia DNA a RNA a trochu sa dotknem proteínov, pretože vo všeobecnosti sú metódy s nimi spojené bližšie k biochémii ako k molekulárnej biológii (hoci hranica medzi nimi je v poslednej dobe veľmi nejasná) .

Strihanie a šitie

Enzýmy sú bielkoviny, ktoré urýchľujú chemické reakcie. Sú veľmi efektívne: zrýchlenie môže byť niekoľko rádov! Napríklad enzým katalázaštiepenie peroxidu vodíka urýchľuje reakciu asi o 12 rádov, teda biliónkrát! Anorganický katalyzátor – jemne dispergovaná platina – zároveň urýchľuje rovnakú reakciu len o šesť rádov, čiže miliónkrát. Pre väčšinu z nich je to však za cenu veľmi prísnych pracovných podmienok.

Reštrikčné endonukleázy

Obrázok 2. Miesta obmedzenia. Vyššie Sma Ja, pri práci ktorej sa tvoria "tupé" konce. Spodná časť- cieľová sekvencia reštrikčného enzýmu Eco RI, počas ktorej sa tvoria „lepkavé“ konce.

Jedným z prvých a najdôležitejších krokov v molekulárnej biológii bola schopnosť rezať molekuly DNA, a to na presne definovaných miestach. Táto metóda bola vynájdená počas štúdie v 50-tych až 70-tych rokoch minulého storočia takéhoto javu: niektoré druhy baktérií, keď bola do prostredia pridaná cudzia DNA, ju zničili, zatiaľ čo ich vlastná DNA zostala nedotknutá. Ukázalo sa, že na to používajú enzýmy, neskôr tzv reštrikčné nukleázy alebo obmedzenia. Existuje mnoho typov restriktáz: do roku 2007 ich bolo známych viac ako 3000. Dôležitou vlastnosťou každého takéhoto enzýmu je jeho schopnosť rezať prísne definované - cieľ- sekvencia nukleotidov DNA (obr. 2). Reštrikčné enzýmy neovplyvňujú vlastnú DNA bunky, pretože nukleotidy v cieľových sekvenciách sú upravené tak, že s nimi reštrikčný enzým nemôže pracovať. (Pravdaže, niekedy, naopak, môžu rezať iba modifikované sekvencie - na boj proti tým, ktorí modifikujú DNA, chránia sa pred vyššie uvedenými reštrikčnými enzýmami.) Vzhľadom na skutočnosť, že cieľové sekvencie majú rôznu dĺžku, ich frekvencia výskytu v molekulách DNA sa mení: čím dlhší je požadovaný fragment, tým menšia je pravdepodobnosť má sa objaviť. V súlade s tým budú mať fragmenty DNA vytvorené počas spracovania rôznymi restriktázami rôzne dĺžky.

Dodnes sa stále objavujú nové endonukleázy. Mnohé z nich ešte neboli klonované, to znamená, že gény, ktoré ich kódujú, nie sú známe a ako „enzým“ sa používa nejaká purifikovaná frakcia proteínov s potrebnou katalytickou aktivitou. Novosibírska firma SibEnzyme dlhodobo úspešne konkuruje New England Biolabs, svetovo uznávanému lídrovi v dodávkach restriktáz (čiže ponúkala rovnaké alebo viac rôznych restriktáz, z ktorých niektoré sú veľmi exotické). - Ed.

Na izoláciu prvého reštrikčného enzýmu, štúdium jeho vlastností a prvé použitie na mapovanie chromozómov Werner Arber ( Werner Arber), Dan Nathans ( Dan Nathans) a Hamilton Smith ( Hamilton Smith) v roku 1978 získal Nobelovu cenu za fyziológiu a medicínu.

DNA ligázy

Na vytvorenie nových molekúl DNA je, samozrejme, okrem rezania potrebné aj možnosť spájať dva reťazce dohromady. Deje sa tak pomocou enzýmov tzv DNA ligázy ktoré zosieťujú cukor-fosfátovú kostru dvoch reťazcov DNA. Pretože chemická štruktúra DNA sa medzi organizmami nelíši, môžete DNA zosieťovať z akéhokoľvek zdroja a bunka nebude schopná rozlíšiť výslednú molekulu od svojej vlastnej DNA.

Separácia molekúl DNA: Gélová elektroforéza

Často sa musíte vysporiadať so zmesou molekúl DNA rôznych dĺžok. Napríklad pri spracovaní DNA chemicky izolovanej z tela pomocou reštrikčných enzýmov sa získa zmes fragmentov DNA a ich dĺžky sa budú líšiť.

Pretože každá molekula DNA vo vodnom roztoku je negatívne nabitá, je možné oddeliť zmes fragmentov DNA rôznych veľkostí pozdĺž ich dĺžky pomocou elektroforéza, . DNA sa umiestni na gél (zvyčajne agaróza pre relatívne dlhé a veľmi odlišné molekuly alebo polyakrylamid pre elektroforézu s vysokým rozlíšením), ktorý je umiestnený v konštantnom elektrickom poli. Z tohto dôvodu sa molekuly DNA budú pohybovať smerom k pozitívnej elektróde ( anóda), a ich rýchlosti budú závisieť od dĺžky molekuly: čím je dlhšia, tým viac jej gél bráni v pohybe, a teda tým nižšia je rýchlosť. Po elektroforéze tvoria zmesi fragmentov rôznych dĺžok v géli pásy zodpovedajúce fragmentom rovnakej dĺžky. Pomocou markerov (zmesi fragmentov DNA známych dĺžok) je možné určiť dĺžku molekúl vo vzorke (obr. 3).

Existujú dva spôsoby, ako vizualizovať výsledky forézy. Prvým, v poslednom čase najčastejšie používaným, je pridávanie látok do gélu, ktoré fluoreskujú v prítomnosti DNA (tradične sa používa skôr toxický etídium bromid, v poslednom čase sa začínajú používať bezpečnejšie látky). Etídiumbromid po ožiarení ultrafialovým svetlom svieti oranžovo a po naviazaní na DNA sa intenzita luminiscencie zvýši o niekoľko rádov (obr. 4). Ďalšou metódou je použitie rádioaktívnych izotopov, ktoré musia byť najskôr zahrnuté do analyzovanej DNA. V tomto prípade sa na vrch gélu umiestni fotografická platňa, ktorá je osvetlená nad pásmi DNA vplyvom rádioaktívneho žiarenia (táto zobrazovacia metóda je tzv. autorádiografia).

Obrázok 4. Elektroforéza na agarózovom géli pomocou etídiumbromidu na vizualizáciu výsledkov v ultrafialovom ( vľavo). Druhá stopa zľava je značka so známymi dĺžkami fragmentov. Napravo- Inštalácia pre elektroforézu v géli.

Okrem „obyčajnej“ elektroforézy v gélovej platni v niektorých prípadoch využívajú kapilárna elektroforéza, ktorá sa vykonáva vo veľmi tenkej skúmavke naplnenej gélom (zvyčajne polyakrylamidom). Rozlíšenie takejto elektroforézy je oveľa vyššie: možno ju použiť na oddelenie molekúl DNA, ktoré sa líšia dĺžkou len jeden nukleotid. Prečítajte si o jednej z dôležitých aplikácií tejto metódy nižšie v popise Sangerovej metódy sekvenovania DNA.

Identifikácia špecifickej sekvencie DNA v zmesi. Southern blotting

Pomocou elektroforézy môžete zistiť veľkosť molekúl DNA v roztoku, ale nepovie vám nič o poradí nukleotidov v nich. Používaním hybridizácia DNA je možné pochopiť, ktorý z pásov obsahuje fragment s prísne definované sekvencie. Hybridizácia DNA je založená na vytvorení vodíkových väzieb medzi dvoma vláknami DNA, čo vedie k ich spojeniu.

Najprv musíte syntetizovať DNA sonda, ktorá je komplementárna k sekvencii, ktorú hľadáme. Zvyčajne ide o jednovláknovú molekulu DNA s dĺžkou 10–1000 nukleotidov. Vďaka komplementarite sa sonda naviaže na požadovanú sekvenciu a vďaka fluorescenčnej značke alebo rádioizotopom zabudovaným do sondy je možné vidieť výsledky.

Na tento účel sa používa postup tzv Southern blotting alebo Južný prenos, pomenované po vedcovi, ktorý ho vynašiel ( Edwin Southern). Na začiatku sa zmes fragmentov DNA oddelí elektroforézou. Na vrch gélu sa umiestni vrstva nitrocelulózy alebo nylonu a oddelené fragmenty DNA sa na ňu prenesú blotovaním: gél leží na špongii v kúpeli s alkalickým roztokom, ktorý presakuje cez gél a nitrocelulózu vďaka kapiláre efekt papierových utierok zložených na vrchu. Pri úniku alkálie spôsobí denaturáciu DNA a už jednovláknové fragmenty sa prenesú na povrch nitrocelulózovej platne a tam sa fixujú. Nitrocelulózová vrstva sa opatrne odstráni z gélu a ošetrí sa rádioaktívne označenou DNA sondou špecifickou pre požadovanú sekvenciu DNA. Nitrocelulózová fólia sa dôkladne umyje, aby na nej zostali len tie molekuly vzorky, ktoré hybridizujú s DNA na nitrocelulóze. Po autorádiografii bude DNA, s ktorou sonda hybridizovala, viditeľná ako pásy na fotografickej platni (obr. 5).

Prispôsobenie tejto techniky na určenie špecifických sekvencií RNA sa na rozdiel od Southern blottingu nazýva Northern blotting (northern blotting: južná v angličtine znamená „južný“ a severný- "severná"). V tomto prípade sa elektroforéza uskutočňuje v géli s molekulami mRNA a ako sonda sa vyberie jednovláknová molekula DNA alebo RNA.

klonovanie DNA

Už vieme, ako rozrezať genóm na časti (a spojiť ich s ľubovoľnými molekulami DNA), rozdeliť výsledné fragmenty pozdĺž dĺžky a vybrať potrebný pomocou hybridizácie. Teraz je čas zistiť, ako kombináciou týchto metód môžeme naklonovať časť genómu (napríklad konkrétny gén). V genóme každý gén zaberá extrémne malú dĺžku (v porovnaní s celou DNA bunky). klonovanie DNA doslova znamená vytvorenie veľkého počtu kópií určitého jeho fragmentu. Je to presne cez toto zosilnenie dostaneme možnosť izolovať kúsok DNA a získať ho v dostatočnom množstve na štúdium.

Ako rozdeliť fragmenty DNA podľa dĺžky a identifikovať požadovaný, bolo opísané vyššie. Teraz musíme pochopiť, ako môžeme skopírovať fragment, ktorý potrebujeme. Existujú dve hlavné metódy: použitie rýchlo sa deliacich organizmov (zvyčajne baktérií Escherichia coli- Escherichia coli - alebo kvasinky Saccharomyces serevisiae) alebo urobte podobný proces, ale in vitro používaním polymerická reťazová reakcia.

replikácie v baktériách

Keďže baktérie (ako každá iná bunka, s výnimkou prekurzorov zárodočných buniek) zdvojnásobujú svoju DNA pri každom bunkovom delení, možno to použiť na znásobenie počtu potrebujeme DNA. Aby sme náš fragment DNA vniesli do baktérie, je potrebné ho „zašiť“ do špeciálneho vektora, ktorý sa zvyčajne používa ako bakteriálny plazmid(malá – vzhľadom na bakteriálny chromozóm – kruhová molekula DNA, ktorá sa replikuje oddelene od chromozómu). Baktérie divokého typu majú často podobné štruktúry: často sa prenášajú „horizontálne“ medzi rôznymi kmeňmi alebo dokonca druhmi baktérií. Najčastejšie obsahujú gény pre rezistenciu voči antibiotikám (práve kvôli tejto vlastnosti boli objavené) alebo bakteriofágy a tiež gény, ktoré bunke umožňujú využívať rozmanitejší substrát. (Niekedy sú „sebecké“ a nenesú žiadne funkcie.) Práve tieto plazmidy sa zvyčajne používajú v molekulárno-genetických štúdiách. Plazmidy nevyhnutne obsahujú počiatok replikácie (sekvenciu, z ktorej replikácia molekuly začína), cieľovú sekvenciu reštrikčného enzýmu a gén, ktorý umožňuje selekciu tých buniek, ktoré majú tento plazmid (zvyčajne sú to gény pre rezistenciu voči nejaké antibiotikum). V niektorých prípadoch (napríklad pri štúdiu veľmi veľkých fragmentov DNA) sa nepoužíva plazmid, ale umelý bakteriálny chromozóm.

Potrebný fragment DNA sa vloží do plazmidu pomocou reštrikčných enzýmov a ligáz, potom sa pridá do bakteriálnej kultúry za špeciálnych podmienok, ktoré poskytujú transformácia- proces aktívneho zachytávania DNA z vonkajšieho prostredia baktériou (obr. 6). Potom sa vyberú baktérie, ktorých transformácia bola úspešná, pridaním antibiotika zodpovedajúceho génu v plazmide: nažive zostanú iba bunky, ktoré nesú gén rezistencie (a následne aj plazmid). Ďalej po raste bunkovej kultúry sa z nej izolujú plazmidy a z nich sa izoluje „náš“ fragment DNA pomocou restriktáz (alebo používam celý plazmid). Ak bol gén vložený do plazmidu, aby sa získal jeho proteínový produkt, je potrebné poskytnúť kultúre podmienky pre rast a potom jednoducho izolovať požadovaný proteín.

V tomto bode by mala okamžite vyvstať otázka: ako by sa to všetko dalo použiť predtým, než boli genómy rozlúštené a čítanie sekvencie DNA bolo stále drahé a nebolo bežné? Predpokladajme, že pomocou obmedzenia a klonovania výsledných fragmentov dostaneme DNA knižnica, teda súbor baktérií nesúcich rôzne plazmidy obsahujúce celkovo celý genóm (alebo jeho nápadnú časť). Ako však môžeme pochopiť, ktorý z fragmentov obsahuje potrebný gén? Na tento účel sa použila hybridizačná metóda. Najprv bolo potrebné izolovať proteín požadovaného génu. Potom sa sekvenuje jeho fragment, obráti sa genetický kód a získa sa nukleotidová sekvencia (samozrejme, kvôli degenerácii genetického kódu bolo treba vyskúšať veľa rôznych možností). V súlade s ním bola chemicky syntetizovaná krátka molekula DNA, ktorá bola použitá ako sonda na hybridizáciu.

Ale v niektorých prípadoch táto metóda zlyhala - napríklad sa to stalo s faktorom zrážanlivosti krvi VIII. Tento proteín sa podieľa na zrážanlivosti krvi a poruchy jeho funkčnosti sú príčinou jedného z najčastejších genetických ochorení – hemofílie A. Predtým bolo potrebné kvôli liečbe izolovať tento proteín z veľkého množstva organizmov, pretože nemohol klonovať na produkciu baktériami. Bolo to spôsobené tým, že jeho dĺžka je asi 180 000 párov báz a obsahuje veľa intrónov (nekódujúcich fragmentov medzi kódujúcimi) - nie je prekvapujúce, že tento gén sa nedostal úplne do žiadneho plazmidu.

O mechanizmoch zrážania krvi pozri " Ako funguje zrážanie krvi? ». - Ed.

Polymerázová reťazová reakcia (PCR)

Metóda je založená na viacnásobnom selektívnom kopírovaní určitého segmentu DNA pomocou enzýmov v umelých podmienkach. V tomto prípade sa skopíruje iba segment DNA, ktorý spĺňa špecifikované podmienky, a to iba vtedy, ak je prítomný v testovanej vzorke. Na rozdiel od replikácie DNA v bunkách živých organizmov sa pomocou PCR amplifikujú relatívne krátke úseky DNA (zvyčajne nie viac ako 3000 párov báz, ale existujú metódy, ktoré umožňujú „vyzdvihnúť“ až 20 tisíc párov báz – tzv. Long Range PCR).

V skutočnosti je PCR umelá viacnásobná replikácia fragmentu DNA (obr. 7). DNA polymerázy sú navrhnuté tak, že nemôžu syntetizovať novú DNA jednoducho tým, že majú k dispozícii templát a monoméry. K tomu potrebujete aj semienko ( základný náter) z ktorých začínajú syntézu. Primér je krátky jednovláknový fragment nukleovej kyseliny, ktorý je komplementárny k templátu DNA. Počas replikácie v bunke sú takéto priméry syntetizované špeciálnym enzýmom prvoradý a sú to molekuly RNA, ktoré sú neskôr nahradené DNA. V PCR sa však používajú umelo syntetizované molekuly DNA, pretože v tomto prípade nie je potrebný krok odstránenia RNA a syntézy DNA na ich mieste. V PCR priméry obmedzujú amplifikovanú oblasť na oboch stranách.

Obrázok 7. Replikácia DNA- najdôležitejší proces pre živé organizmy, základ mnohých molekulárno-biologických metód. Keďže každý z reťazcov DNA obsahuje sekvenciu nukleotidov, ktorá je komplementárna s druhým reťazcom (ich informačný obsah je rovnaký), pri duplikácii DNA sa reťazce rozchádzajú a potom každý reťazec slúži ako templát, na ktorom sa vytvorí nový reťazec DNA. komplementárne k nemu je postavené. V dôsledku toho sa vytvoria dva duplexy DNA, z ktorých každý je presnou (bez zohľadnenia chýb syntézy) kópiou pôvodnej molekuly.

Takže je čas vysvetliť, ako PCR funguje. Na začiatku reakčná zmes obsahuje: templát DNA, priméry, DNA polymerázu, voľné nukleozidy (budúce „písmená“ v novosyntetizovanej DNA), ako aj niektoré ďalšie látky, ktoré zlepšujú fungovanie polymerázy (pridávajú sa do špeciálnych pufrov). použité v reakcii).

Na syntézu DNA komplementárnej s templátom je potrebné, aby s ňou jeden z primérov vytvoril vodíkové väzby (ako sa hovorí, „žíhal“ na nej). Ale matrica ich už tvorí s druhým reťazcom! Takže najprv musíte roztopiť DNA – teda zničiť vodíkové väzby. A to jednoduchým ohrevom (až ≈95 °C) – etapa tzv denaturácia. Teraz však primery nemôžu horieť na matrici kvôli vysokej teplote! Potom sa teplota zníži (50–65 °C), priméry sa vyžíhajú, potom sa teplota mierne zvýši (až na optimálnu prevádzku polymerázy, zvyčajne okolo 72 °C). A potom začne polymeráza syntetizovať reťazce DNA komplementárne s templátom - to sa nazýva predĺženie(obr. 8). Po jednom takomto cykle sa počet kópií požadovaných fragmentov zdvojnásobil. Nič vám však nebráni urobiť to znova. A nie len raz, ale desiatky krát! A s každým opakovaním sa počet kópií nášho fragmentu DNA zdvojnásobí, pretože novosyntetizované molekuly budú slúžiť aj ako šablóny (obr. 9)! (V skutočnosti je účinnosť PCR zriedka taká vysoká, že počet kópií štvorhra, ale v ideálnom prípade je to tak a reálne čísla sa tomu často približujú.)

Obrázok 9. S každým cyklom PCR sa množstvo cieľovej DNA zdvojnásobí.

Je veľmi ľahké vidieť výsledky PCR: stačí vykonať elektroforézu reakčnej zmesi po PCR a bude viditeľný jasný pás so získanými kópiami.

Predtým bolo potrebné neustále pridávať tepelne inaktivovanú polymerázu s každým cyklom, ale čoskoro sa navrhlo použiť termostabilnú polymerázu z termofilných baktérií, ktoré takéto teplo znesú, čo značne zjednodušuje PCR (najbežnejšie používaná Taq polymeráza z baktérií Thermus aquaticus ).

Aby sa zabránilo silnému odparovaniu vody z reakčnej zmesi, pridáva sa olej, ktorý ju zakryje zhora a/alebo sa použije vyhrievané veko. termocykler- zariadenie, v ktorom sa vykonáva PCR. Rýchlo mení teplotu skúmaviek a tie nemusia neustále prepínať z jedného termostatu na druhý. Aby som predišiel nešpecifickej syntéze ešte pred zahriatím a samotným spustením cyklov, často používam PCR s „horúcim štartom“: všetka DNA a polymeráza sú od seba oddelené parafínovou vrstvou, ktorá sa topí pri vysokej teplote a umožňuje interagovať už za správnych podmienok. Niekedy sa používajú modifikované polymerázy, ktoré nefungujú pri nízkych teplotách.

O rôznych jemnostiach PCR sa dá povedať oveľa viac, ale najdôležitejšie je povedať o alternatívnych metódach určovania výsledkov ku klasickej foréze. Napríklad celkom samozrejmou možnosťou je pridanie látok, ktoré fluoreskujú v prítomnosti DNA, do reakčnej skúmavky pred začatím reakcie. Potom porovnaním počiatočnej fluorescencie s konečnou je možné zistiť, či sa syntetizovalo významné množstvo DNA alebo nie. Ale táto metóda nie je špecifická: nebudeme môcť žiadnym spôsobom určiť, či nevyhnutné fragment, alebo sú to nejaké priméry, ktoré sa zlepujú a vytvárajú nepredvídateľné sekvencie.

Najzaujímavejšou možnosťou je PCR "real time" ("real-time PCR"). Existuje niekoľko implementácií tejto metódy, ale myšlienka je všade rovnaká: môžete priamo pozorovať akumuláciu produktov PCR (fluorescenciou) počas reakcie. V súlade s tým vyžaduje PCR v reálnom čase špeciálny prístroj, ktorý dokáže excitovať a čítať fluorescenciu v každej skúmavke. Najjednoduchším riešením je pridať do skúmavky tie isté látky, ktoré fluoreskujú v prítomnosti DNA, ale nevýhody tejto metódy už boli popísané vyššie.

Toto sa striktne označuje ako "fluorescenčná PCR v reálnom čase" alebo "kvantitatívna PCR". - Ed.

Obrázok 11. Príklad kriviek akumulácie fluorescencie v real-time PCR: závislosť intenzity fluorescencie (vo viacerých skúmavkách - pre každú vlastnú krivku) od čísla cyklu.

Najpopulárnejšou implementáciou tohto prístupu je metóda štiepenia fluorofórom v dôsledku deštrukcie sondy (TaqMan Assay; Obr. 10). V tomto prípade by reakčná zmes mala obsahovať ešte jednu zložku - špeciálnu jednovláknovú DNA sondu: molekulu DNA komplementárnu k sekvencii amplifikovaného fragmentu umiestnenú medzi primery. Súčasne by mal byť jeden z jeho koncov chemicky pripevnený fluorofor(fluorescenčná molekula) a do druhej - zhášač (molekula, ktorá absorbuje energiu fluorofóru a "zháša" fluorescenciu). Keď je takáto sonda v roztoku alebo je komplementárna k cieľovej sekvencii, fluorofór a zhášač sú relatívne blízko seba a nepozoruje sa žiadna fluorescencia. Avšak kvôli 3´-exonukleázovej aktivite, ktorú má Taq polymeráza (to znamená, že štiepi DNA, na ktorú počas syntézy „narazí“ a namiesto nej syntetizuje novú), sa sonda zničí pri syntéze druhej fluorofór a zhášač v dôsledku difúzie sa od seba vzdialia a objaví sa fluorescencia.

Keď sa počet kópií počas PCR exponenciálne zvyšuje, zvyšuje sa aj fluorescencia. To však netrvá dlho, keďže v určitom okamihu začne účinnosť reakcie klesať v dôsledku postupnej inaktivácie polymerázy, nedostatku niektorých zložiek a pod. (obr. 11). Analýzou grafov rastu fluorescencie možno veľa pochopiť o procese PCR, ale čo je najdôležitejšie, možno zistiť, koľko templátov DNA bolo pôvodne: ide o tzv. kvantitatívna PCR(kvantitatívna PCR, qPCR).

Nie je možné vymenovať všetky aplikácie PCR vo vede. Izolácia fragmentu DNA, sekvenovanie, mutagenéza... PCR je jednou z najpopulárnejších metód na nevedecké účely (video 1). Je široko používaný v medicíne na včasnú diagnostiku dedičných a infekčných chorôb, určenie otcovstva, pri vyšetrovaní totožnosti a mnoho ďalších.

Prirodzené bunkové procesy in vitro

Všetky hlavné molekulárne biologické procesy sa dajú ľahko uskutočniť in vitro(teda v skúmavke). Príklad je uvedený vyššie: PCR je analogická replikácii DNA. Za týmto účelom jednoducho zmiešajte potrebné činidlá za vhodných podmienok: transkripcia vyžaduje templát DNA, RNA polymerázu a ribonukleotidy, translácia vyžaduje mRNA, podjednotky ribozómov a aminokyseliny, reverzná transkripcia vyžaduje templát RNA, reverznej transkriptázy(aka revertáza) a deoxyribonukleotidy. Tieto metódy sú široko používané v rôznych oblastiach biológie, keď je potrebné napríklad získať čistú RNA konkrétneho génu. V tomto prípade musíte najprv reverzne prepísať jeho (génovú) mRNA, amplifikovať ju pomocou PCR a potom použiť in vitro- transkripcia získať veľa mRNA. Prvá fáza je nevyhnutná vzhľadom na to, že pred tvorbou zrelej mRNA v bunke, spájanie a spracovanie RNA (v eukaryotoch; v baktériách je v tomto zmysle všetko jednoduchšie) - príprava na prácu ako matrica na syntézu bielkovín. Niekedy sa tomu dá vyhnúť, ak sa celá kódujúca sekvencia génu nachádza v jednom exóne.

Sekvenovanie DNA

Dá sa povedať, že najdôležitejšie spôsoby manipulácie s DNA už boli popísané. Ďalším krokom je určenie aktuálnej nukleotidovej sekvencie reťazca v molekule - sekvenovanie. Stanovenie nukleotidovej sekvencie DNA je mimoriadne dôležité pre mnohé základné a aplikované problémy. Vo vede zaujíma osobitné miesto: na analýzu výsledkov sekvenovania genómu bola v skutočnosti vytvorená nová veda - bioinformatika. Sekvenovanie dnes používajú molekulárni biológovia, genetici, biochemici, mikrobiológovia, botanici a zoológovia a, samozrejme, evolucionisti: na jeho výsledkoch je založená takmer celá moderná systematika. Sekvenovanie je široko používané v medicíne ako metóda vyhľadávania dedičných chorôb a štúdia infekcií. (Pozri napr. Objasnenie "rodokmeňa" článkonožcov" a " Sk skutočná anekdota: Negro, Číňan a Craig Venter ... ». - Ed.)

V skutočnosti boli chronologicky metódy vynájdené v úplne inom poradí. Napríklad Sangerovo sekvenovanie bolo vyvinuté v roku 1977 a PCR, ako je uvedené vyššie, až v roku 1983.

Existuje mnoho rôznych techník sekvenovania, ale všetky metódy možno rozdeliť do dvoch kategórií: „klasické“ a nové generácie. Teraz sa v skutočnosti používa iba jedna „klasická“ metóda - Sangerovo sekvenovanie alebo metóda terminátora. Oproti novým metódam má dôležitú výhodu: čítacia dĺžka, teda počet nukleotidov v sekvencii, ktoré je možné získať naraz, je vyššia – až 1000 nukleotidov. V rovnakej dobe, najviac "dobré" v tomto smere "nová" sekvenčná metóda - 454-, alebo pyrosekvenovanie - tento parameter nepresahuje 500 nukleotidov. Práve dĺžka čítania limituje možnosti nových metód: „poskladať“ celý genóm z fragmentov o veľkosti niekoľkých desiatok nukleotidov sa ukazuje byť mimoriadne náročné. To si vyžaduje minimálne superpočítače a niektoré miesta v genóme je jednoducho nemožné vyriešiť, ak obsahujú vysoko sa opakujúce sekvencie. V tomto prípade môže pomôcť porovnanie získaných fragmentov s už existujúcim celým genómom, ale takto je nemožné prečítať genóm organizmu na prvýkrát ( de novo). (Pozri tiež: " Kód života: čítať neznamená rozumieť ». - Ed.)

Anglický biochemik a významný predstaviteľ molekulárnej biológie, dvojnásobný nositeľ Nobelovej ceny za chémiu: za určenie sekvencie aminokyselín inzulínu (1955) a za vývoj metódy sekvenovania DNA (1980). - Ed.

Existuje metóda novej generácie, ktorá vám umožňuje prečítať niekoľko tisíc mon, ale s veľkými chybami (Pacific Biosciences). 454/Roche dnes dokáže prečítať viac ako 500 po; mladé „sekvenovanie polovodičov“ už dokáže to isté. - Ed.

Obe vyššie spomenuté sekvenčné metódy už boli dostatočne podrobne popísané o „biomolekule“: Dôrazne vám odporúčam, aby ste sa zoznámili. Napríklad vám poviem o ďalšej bežnej rýchlej a lacnej metóde (na jeden prečítaný nukleotid) - metóde implementovanej v sekvenátoroch Illumina (video 2). Jeho hlavnou nevýhodou je čítanie fragmentov veľmi krátkej dĺžky, nie viac ako 100 nukleotidov, a z toho vyplývajúce ťažkosti pri čítaní genómu od začiatku.

Pri tejto metóde možno rozlíšiť tri stupne: príprava knižnice fragmentov (1), vytváranie zhlukov (2) a samotné sekvenovanie (3).

Video 2. Na internete je niekoľko dobrých videí, ktoré popisujú proces sekvenovania Illumina, napríklad na oficiálnej stránke spoločnosti (záložka Technológia). Všetky sú však v angličtine.

O metódach práce s nukleovými kyselinami a ich štúdiu sa toho popísalo už pomerne veľa. Je čas zistiť, ako môžete zistiť, ako bunka funguje – skúste najmä určiť funkciu génu a proteínu, ktorý kóduje.

In vitro-mutagenéza

Ak chcete študovať funkciu proteínu, je veľmi dôležité naučiť sa, ako ho zaviesť mutácie. Napríklad, ak máte organizmus s nefunkčným enzýmom, pomocou biochemických rozdielov môžete pochopiť, čo robí normálny proteín. Existujú rôzne spôsoby, ako vytvoriť úplne nefunkčný gén (aj ľubovoľný z celého genómu, aj úplne špecifický - potom je to tzv. Knock Out tento gén). Jednou z týchto metód je vloženie nejakého fragmentu DNA do genómu: ak toto vloženie padne na gén, potom tento (presnejšie povedané, s najväčšou pravdepodobnosťou proteín, ktorý kóduje) prestane normálne fungovať.

Existujú však spôsoby, ako veľmi presne zmeniť sekvenciu génu a teda aj proteínu. O jednej z týchto metód - miestne špecifická mutagenéza- Poviem ti. Jeho podstatou je zmena konkrétneho (zvyčajne jedného) nukleotidu v sekvencii. Aby ste ho mohli použiť, musíte tento gén najskôr naklonovať do plazmidu. Potom je potrebné vykonať, ako to bolo, PCR s jedným primérom. Okrem toho by tento primér mal obsahovať iba sekvenciu, ktorú chceme zmeniť - už vo forme, ktorú potrebujeme. Napríklad na obr. 14, namiesto písmena A, ktoré malo byť oproti T v rodičovskom reťazci, primér obsahuje C. Po syntéze druhého vlákna DNA plazmidu obsahujúceho primér sa do neho zavedie mutácia - A nahradené C. Takéto plazmidy sa zavádzajú do buniek, v ktorých pri delení dva reťazce skončia v rôznych dcérskych bunkách. Polovica buniek potomstva bude mať teda pôvodnú verziu plazmidu a polovica bude mať mutantnú verziu. Potom bude polovica buniek produkovať normálny proteín kódovaný týmto génom a polovica bude produkovať mutantný proteín. V prípade znázornenom na obr. 14, namiesto jednej aminokyseliny (asparagín) bude iná (alanín). Analogicky je možné zaviesť náhodné mutácie pomocou špeciálnej DNA polymerázy, ktorá prináša zvýšený počet chýb.

Obrázok 14. Schéma miestne špecifickej mutagenézy.C.elegans, - teda o vypnutí génu vo všetkých (takmer) bunkách tohto červa.

Takýto výrazný účinok sa dosiahne zavedením molekúl dvojvláknovej RNA (dsRNA) do bunky, pričom jeden z reťazcov v každom z nich je komplementárny k časti mRNA „vypnutého“ génu. To otvára úžasné možnosti pre štúdium funkcií génov. Predtým bolo na deaktiváciu génov potrebné vytvoriť „knokautované“ zvieratá (čo vedci stále musia robiť napríklad s myšami – pozri „ Nobelova cena za fyziológiu alebo medicínu udelená za technológiu na vyradenie myší ». - Ed.), v ktorej sa skúmaný gen v podstate chýba v genóme. Vytvorenie knockoutov je však dosť ťažké a opätovné zapnutie génu v takýchto organizmoch už nie je možné. Pomocou interferencie RNA je veľmi ľahké vypnúť gén, rovnako ako ho zapnúť, po zastavení zavádzania zodpovedajúcej dsRNA do tela.

Existujú tri hlavné spôsoby zavedenia dsRNA do tela. Najzrejmejšia je injekcia ich roztoku do zvieraťa. Používajú aj „namáčanie“ háďatiek v roztoku RNA. Ukázalo sa však, že všetko môžete urobiť oveľa jednoduchšie: nakŕmte týmito molekulami háďatká! Navyše je obzvlášť výhodné, že funguje skvele, ak sú háďatká kŕmené baktériami ( E. coli), ktoré syntetizujú tieto dsRNA (obr. 15).

Obrázok 15. Systémová interferencia RNA.Červ C.elegans exprimuje zeleno fluoreskujúci (svietiaci) proteín v bunkách hltana (ph) a svaloch steny tela (bm). Vľavo- počiatočný vzhľad. Napravo- pri interferencii RNA za pomoci "kŕmenia" baktériami dochádza k inaktivácii génu.

V zásade je celkom prekvapivý fakt, že molekuly RNA z čriev sú distribuované takmer do všetkých tkanív. Je známe, že proteínový kanál je zodpovedný za vstup molekúl RNA do črevných buniek. sid-1, . Nie je však isté, ako je RNA distribuovaná v tele červa, s najväčšou pravdepodobnosťou za účasti proteínu. rsd-8 Je zaujímavé, že všetky známe proteíny zapojené do systémovej RNA interferencie v C.elegans, sú prítomné aj u ľudí, ale takýto účinný systém umelého potlačenia aktivity génov na systémovej úrovni u ľudí nie je možné pozorovať. Ak by bolo možné použiť systémovú RNAi u ľudí, mohol by to byť spôsob, ako bojovať proti obrovskému množstvu chorôb, od bežnej nádchy až po rakovinu.

Mimochodom, použitie RNA interferencie špecificky na kultúru ľudských buniek umožnilo odhaliť veľa ľudských génov prispieť vývoj vírusu chrípky: Molekulárne dvojité pôsobenie: ľudské gény pracujú na víruse chrípky ». - Ed.

Štúdium génovej expresie: DNA Microarrays

Pri štúdiu funkcie génu je veľmi dôležité zistiť, kedy a v akých tkanivách tela funguje (je exprimovaný), ako aj spolu s akými ďalšími génmi. Ak to chcete vedieť o malom počte génov a tkanív, môžete to urobiť veľmi jednoducho: izolovať RNA z tkaniva, reverznú transkripciu (to znamená syntetizovať cDNA - komplementárna DNA) a potom vykonajte kvantitatívnu PCR. Podľa toho, či prešla PCR, zistíme, či sa v tkanive nachádza mRNA skúmaného génu.

Ak je však potrebné urobiť to isté pre mnohé tkanivá a mnohé gény, potom sa táto technika stáva veľmi dlhou a nákladnou. V takom prípade použite DNA mikročipy. Sú to malé doštičky, na ktoré sú nanesené a pripojené molekuly DNA, komplementárne k RNA študovaných génov, pričom je vopred známe, kde sa na nich (doštičkách) ktorá molekula nachádza. Jedným zo spôsobov, ako vytvoriť čip, je syntetizovať molekuly DNA priamo na ňom pomocou robota.

Na štúdium génovej expresie pomocou čipov je tiež potrebné syntetizovať ich cDNA a označiť ju fluorescenčným farbivom (bez separácie cDNA rôznych génov). Táto zmes sa aplikuje na mikročip, čím sa zabezpečí, že cDNA hybridizuje s molekulami DNA na čipe. Potom sa pozrú na miesto, kde sa fluorescencia pozoruje, a porovnajú ju s umiestnením molekúl DNA na čipe. Ak sa miesto fluorescencie zhoduje s polohou molekuly DNA, potom je tento gén exprimovaný v tomto tkanive. Navyše, označením cDNA z rôznych tkanív rôznymi farbivami je možné študovať expresiu niekoľkých (zvyčajne nie viac ako 2) tkanív na jednom čipe naraz: fluorescenčnú farbu možno použiť na určenie, v ktorom z tkanív je vyjadrená (ak je vyjadrená vo viacerých tkanivách naraz, ukáže sa, že je zmiešaná). farba) (obr. 16).

V posledných rokoch sa však namiesto čipov používa hromadné sekvenovanie celej cDNA z tkaniva (tvorba tzv. prepisy), ktorý bol značne zjednodušený vďaka vývoju metód sekvenovania. Ukázalo sa, že je to lacnejšie a efektívnejšie, pretože poznanie kompletných sekvencií všetkých mRNA poskytuje viac informácií ako len samotný fakt o ich prítomnosti alebo neprítomnosti.

Zhrnuli sme základné metódy molekulárnej biológie. Dúfam, že je vám trochu jasnejšie, ako sa robí molekulárno-biologický výskum, na čo sú Nobelove ceny a ako môžu pomôcť v niektorých aplikovaných problémoch. Ale hlavne dúfam, že aj vy ste videli krásu myšlienok, ktoré sa za nimi skrývali, a možno by ste sa chceli o niektorých z týchto techník dozvedieť viac.

Literatúra

1. Laureáti Nobelovej ceny: J. Watson, F. Crick, M. Wilkins, Wikipedia: 454-sekvenovanie (vysokovýkonné pyrosekvenovanie DNA). Cold Spring Harbor Symposia o kvantitatívnej biológii. 71 , 95-100.

Pre koho? Stredoškoláci, študenti.
Čo dáva? Znalosť základov molekulárnej biológie.
Učitelia. Vedúci Laboratória molekulárnej genetiky mikroorganizmov na Ústave génovej biológie Ruskej akadémie vied, profesor na Rutgers University (USA), profesor na Skolkovskom inštitúte vedy a techniky (SkolTech).
Kedy? Treba si to ujasniť.
Cena. 9 000 rubľov.
Podmienky účasti. Na stránke je potrebné zanechať žiadosť o účasť.

Biologické kruhy. Moskovská štátna univerzita M.V. Lomonosov.

Pre koho? 9.-11.ročník.
Čo dáva? Znalosť biológie, zručnosť vykonávať dizajnérske práce, zručnosť práce v laboratóriu.
Učitelia. Zamestnanci biologickej fakulty Moskovskej štátnej univerzity.
Kedy?
Cena. Treba si to ujasniť.
Podmienky účasti. Treba si to ujasniť.

Biologické oddelenie moskovského gymnázia č. 1543 na juhozápade.

Pre koho? 7-10 ročníkov.
Čo dáva? Pokročilé znalosti z biológie.
Učitelia. Zamestnanci Moskovskej štátnej univerzity, absolventi gymnázia.
Kedy? Je možné sledovať dátum začiatku náboru.
Povinné požiadavky. Je potrebné absolvovať prijímacie skúšky.
Cena. Zadarmo (existuje dobrovoľný príspevok).
Podmienky účasti. Prijatie na gymnázium na plnohodnotné vzdelávanie.

Škola "Chem*Bio*Plus". Ruská národná výskumná lekárska univerzita pomenovaná po N.I. Pirogov.

Pre koho? 10-11 ročníkov.
Čo dáva? Vedomosti z biológie, chémie.
Kedy? Set - ročne, v septembri.
Povinné požiadavky. Nastavte na základe výsledkov testov.
Cena. 10 000 - 75 000 rubľov (existuje skúšobná lekcia).

akadémie. "PostScience".

Pre koho?Školáci, študenti.
Čo dáva?

• znalosti v oblasti fyziky elementárnych častíc, chémie, medicíny, matematiky, neurofyziológie, genetiky, sociológie, informatiky;
• znalosti o tom, ako sa vedecký vývoj uplatňuje v reálnom živote.

Učitelia. Vysoko kvalifikovaní odborníci, vedci.
Kedy? Je možné sledovať termíny náborov V kontakte s a Facebook.
Cena. 9 000 rubľov.
Podmienky účasti. Musíte sledovať správny kurz. Zaregistrujte sa na kurz a zaplaťte za kurz.

Petrozavodsk

STEM centrum Petrozavodskej štátnej univerzity.

Pre koho? 1-11 ročníkov.
Čo dáva? Zručnosti dizajnu, výskumná činnosť v oblasti programovania, biológie, chémie, fyziky.
Kedy? Je možné sledovať dátum začiatku náboru.
Cena. Treba si to ujasniť.
Podmienky účasti.Študenti Petrozavodských škôl.

Otvorené univerzitné lýceum Petrozavodskej štátnej univerzity.

Pre koho? 10. ročník
Čo dáva?

• technický smer (fyzika, matematika, informatika, ruský jazyk);
• biomedicínske (chémia, biológia, ruský jazyk).

Kedy? Je možné sledovať dátum začiatku náboru.
Cena. Treba si to ujasniť.
Podmienky účasti. Občianstvo Ruskej federácie, prihláška, školné.

Majstrovské kurzy

"Štruktúra a funkcie bunky" - lekcia v múzeu.

Pre koho? 14-16 rokov.
Čo dáva?

• praktické zručnosti v biológii;
• mikroskopické zručnosti;
• experimentálna zručnosť.

Kedy? Treba si to ujasniť.
Cena. Treba si to ujasniť.
trvanie. 90 minút.
Špeciálne podmienky pre návštevu. Posledný utorok v mesiaci je sanitárny deň.
Ako sa prihlásiť? Zanechajte žiadosť na stránke.

"Svet pod mikroskopom".

Pre koho? 6-16 rokov.
Čo dáva? Pozorovanie mikroorganizmov, bunkovej štruktúry pod mikroskopom.
Kedy? Treba si to ujasniť.
Cena. 200 r.
trvanie. 1 hodina.
Špeciálne podmienky pre návštevu. Skupinové vyučovanie (pre návštevníkov od 6 rokov) prebieha cez víkendy a školské prázdniny podľa rozvrhu.
Ako sa prihlásiť? Zanechajte žiadosť na stránke.

Lekcia chémie "Najúžasnejšia látka na Zemi."

Pre koho? 14-16 rokov.
Čo dáva?

• znalosti o vlastnostiach vody;
• schopnosť vykonávať laboratórne experimenty.

Kedy? Treba si to ujasniť.
Cena. 16 000 rubľov pre dvojitú skupinu po 15 ľudí.
trvanie. 90 minút.

táborov

Moskovská oblasť

Chemický tábor „Slon a žirafa“.

Pre koho? 9.-11.ročník.
Kedy? Ročne.
Čo dáva?

• znalosť chémie;
• reagenčné zručnosti.

Poznámka: tréningové programy menia každú zmenu, preto je potrebné si s organizátormi ujasniť ich obsah.
Učitelia. Vysokokvalifikovaní lekári rôznych špecializácií, profesionálni biológovia, vedci.
Cena. 32 000 rubľov
Podmienky účasti. Musíte podať žiadosť na stránke.

Vzdelávacie centrum Sirius. Smer "Veda". Posuny "Chémia", "Biológia".

Pre koho? 10-17 rokov.
Čo dáva? Hlboká znalosť základných predmetov, rozšírenie obzorov a osobný rozvoj.
Učitelia. Vedci, učitelia popredných univerzít, fyzikálno-matematických a chemicko-biologických škôl, tréneri národných a regionálnych tímov z matematiky, fyziky, chémie a biológie.
Kedy? Ročne. Je možné sledovať termíny náborov.
Povinné požiadavky. Hlboká znalosť odborných predmetov, úroveň celoruských, medzinárodných olympiád.
Cena. Je zadarmo.
Podmienky účasti. Použiť na stránke. Konkurenčný výber je možný. Podrobnosti je potrebné overiť u organizátorov alebo sledovať na webovej stránke.

univerzity

Moskovská štátna univerzita M.V. Lomonosov.

Katedra biológie.
Rok vytvorenia: 1930.
Čo dáva?
kvalifikácia:

Ruská národná výskumná lekárska univerzita pomenovaná po N.I. Pirogov.

Katedra biochémie a molekulárnej biológie.
Rok vytvorenia: 1963.
Čo dáva? Pripravuje kvalifikovaných odborníkov.
kvalifikácia:špecialista, doba školenia - 6 rokov.

Novosibirsk

Štátna univerzita v Novosibirsku.

Fakulta prírodných vied. Biologické oddelenie. Katedra molekulárnej biológie.
Rok vytvorenia: 1959.
Čo dáva? Pripravuje kvalifikovaných odborníkov.
kvalifikácia: bakalár, doba štúdia - 4 roky, magisterské - 2 roky.

Online kurzy

V ruštine

"Skutočná matematika". Elektronická škola "Znanika".

Pre koho? 5.-9.ročník.
Čo dáva? Hlboká znalosť matematiky.
Kedy? Kedykoľvek.
Učitelia. Kandidáti fyzikálnych a matematických, pedagogických vied, docenti, profesori a učitelia popredných univerzít v krajine.
Podmienky účasti. Vyžaduje sa registrácia.

Virtuálne chemické laboratórium. Štátna technická univerzita v Mari.

Pre koho? 8-11 ročníkov.
Čo dáva? Zručnosť práce v chemickom laboratóriu, zručnosť vykonávať experimenty v reálnom čase.
Cena. 3 500 - 9 000 rubľov
Podmienky účasti. Odhlásiť sa.

Mark Zentrum. Medzinárodné vzdelávacie online centrum.

Pre koho? Od 11 rokov.
Čo dáva? Vzdelávacie programy z biológie, chémie, matematiky, cudzích jazykov.
Kedy? Individuálne hodiny sú dohodnuté s vyučujúcim. Skupinové hodiny prebiehajú podľa rozvrhu.
Učitelia. Lingvisti, cviční učitelia odborných predmetov.
Cena. Skúšobná lekcia je bezplatná. Individuálne lekcie: jedna lekcia - 450–1200 rubľov, v závislosti od počtu lekcií (minimálne päť) a dĺžky lekcie. Skupinové lekcie: jedna lekcia - 280–640 rubľov.
Náklady na hodiny cudzích jazykov. Skúšobná hodina s rodeným hovorcom- zaplatené: 10 eur. Cena jednej lekcie: 15-35 eur v závislosti od dĺžky lekcie.
trvanie. Závisí od formy práce. Individuálna lekcia - 45–90 minút, skupinová lekcia - 90 minút, webinár - 120 minút. Prvá skúšobná lekcia trvá 30-40 minút.
Podmienky účasti. Vyplňte prihlášku na skúšobnú hodinu.
Špeciálne podmienky. Potrebné materiály a učebnice zasiela vyučujúci v elektronickej podobe (možnosť zakúpenia študijných materiálov v tlačenej forme).

V angličtine

Prednáška. Prekvapenia a objavy v katalýze.

Pre koho?Školáci, študenti.
Čo dáva? Znalosť najnovších pokrokov v katalýze.
Učitelia. Erick M. Carreira, profesor organickej chémie na univerzite v Zürichu.
Kedy? Kedykoľvek.
Cena. Je zadarmo.

Virtulab v chémii v angličtine. Je možné nastaviť ruský jazyk.

Pre koho?Žiaci.
Čo dáva? Zručnosť v práci v laboratóriu so stovkami činidiel v reálnom čase.
Kedy? Kedykoľvek.
Cena. Je zadarmo.

Detektívny chemický virtulab. Vyšetrovanie trestného činu s pomocou znalostí chémie.

Pre koho?Školáci, študenti.
Čo dáva? Zručnosť aplikovať poznatky z chémie hravou formou.
Kedy? Kedykoľvek.
Trvanie úlohy. 40 – 50 minút.
Cena. Je zadarmo.
Podmienky účasti. Stiahnite si program do počítača.