Najważniejsze metody biologii molekularnej i inżynierii genetycznej. Biolog molekularny

Rozwój biochemii, biofizyki, genetyki, cytochemii, wielu działów mikrobiologii i wirusologii około początku lat 40. XX wieku. ściśle doprowadził do badania zjawisk życiowych na poziomie molekularnym. Sukcesy osiągnięte przez te nauki jednocześnie i z różnych stron doprowadziły do ​​uświadomienia sobie faktu, że to na poziomie molekularnym funkcjonują główne systemy kontroli organizmu i że dalszy postęp tych nauk będzie zależał od ujawnienia biologiczne funkcje cząsteczek budujących ciała organizmów, ich udział w syntezie i rozpadzie, wzajemnych przemianach i odtwarzaniu związków w komórce, a także zachodząca w tym przypadku wymiana energii i informacji. Tak więc na styku tych dyscyplin biologicznych z chemią i fizyką powstała zupełnie nowa dziedzina – biologia molekularna.

W przeciwieństwie do biochemii, uwaga współczesnej biologii molekularnej skupia się głównie na badaniu struktury i funkcji najważniejszych klas biopolimerów – białek i kwasów nukleinowych, z których pierwsze warunkują samą możliwość zachodzenia reakcji metabolicznych, a drugie – biosynteza określonych białek. Jest zatem jasne, że niemożliwe jest dokonanie wyraźnego rozróżnienia między biologią molekularną a biochemią, odpowiadającymi im gałęziami genetyki, mikrobiologii i wirusologii.

Powstanie biologii molekularnej było ściśle związane z rozwojem nowych metod badawczych, które zostały już omówione w odpowiednich rozdziałach. Wraz z rozwojem mikroskopii elektronowej i innych metod techniki mikroskopowej ważną rolę odegrały opracowane w latach pięćdziesiątych metody frakcjonowania pierwiastków komórkowych. Opierały się one na udoskonalonych metodach wirowania różnicowego (A. Claude, 1954). W tym czasie istniały już dość niezawodne metody izolacji i frakcjonowania biopolimerów. Obejmuje to w szczególności metodę frakcjonowania białek metodą elektroforezy zaproponowaną przez A. Tiseliusa (1937; Nagroda Nobla, 1948), metody izolacji i oczyszczania kwasów nukleinowych (E. Kay, A. Downs, M. Sevag, A. Mirsky i inne.). W tym samym czasie w wielu laboratoriach świata opracowano różne metody analizy chromatograficznej (A. Martin i R. Sing, 1941; Nagroda Nobla, 1952), a następnie znacznie udoskonalono.

Analiza dyfrakcji rentgenowskiej odegrała nieocenioną rolę w rozszyfrowaniu struktury biopolimerów. Podstawowe zasady analizy dyfrakcji rentgenowskiej zostały opracowane na King's College London University pod kierownictwem W. Bragga przez grupę naukowców, w skład której wchodzili J. Bernal, A. Londsdale, W. Astbury, J. Robertson i inni.

Na szczególną uwagę zasługują badania Protoplazmy Biochemii (1925 - 1929), profesora Moskiewskiego Uniwersytetu Państwowego A. R. Kizla, które miały ogromne znaczenie dla późniejszego rozwoju biologii molekularnej. Kizel zadał cios mocno zakorzenionemu poglądowi, że każda protoplazma opiera się na specjalnym ciele białkowym - płytkach, które rzekomo determinuje wszystkie jej najważniejsze cechy strukturalne i funkcjonalne. Pokazał, że płytki są białkiem, które występuje tylko w myksomycetach i to na pewnym etapie rozwoju, aw protoplazmie nie ma żadnego stałego składnika - pojedynczego białka szkieletowego. Tak więc badanie problemu struktury protoplazmy i funkcjonalnej roli białek obrało właściwą drogę i otrzymało pole do rozwoju. Badania Kisela zyskały uznanie na całym świecie, stymulując badania chemii części składowych komórki.

Termin „biologia molekularna”, użyty po raz pierwszy przez angielskiego krystalografa W. Astbury'ego, profesora Uniwersytetu w Leeds, pojawił się prawdopodobnie na początku lat czterdziestych (przed 1945). Podstawowe badania dyfrakcji rentgenowskiej białek i DNA, przeprowadzone przez Astbury'ego w latach trzydziestych XX wieku, posłużyły jako podstawa do późniejszego pomyślnego rozszyfrowania drugorzędowej struktury tych biopolimerów. W 1963 r. J. Bernal napisał: „Pomnik postawi mu cała biologia molekularna – nauka, którą nazwał i rzeczywiście założył”*. W literaturze termin ten pojawił się po raz pierwszy być może w 1946 r. w artykule W. Astbury'ego „Progress in X-ray diffraction analysis of organic and fibrilar cells”, opublikowanym w angielskim czasopiśmie „Nature”**. W swoim wykładzie Harveya Astbury (1950) zauważył: "Cieszę się, że termin biologia molekularna jest obecnie dość szeroko stosowany, chociaż jest mało prawdopodobne, żebym był pierwszym, który go zaproponował. Podobał mi się i od dawna próbowałem go rozpowszechnić ***. Już w 1950 roku Astbury jasno zdawał sobie sprawę, że biologia molekularna zajmuje się przede wszystkim strukturą i konformacją makrocząsteczek, których badanie ma decydujące znaczenie dla zrozumienia funkcjonowania organizmów żywych.

* (biogr. pam. Koledzy Roy. Soc, 1963, t. 9, 29.)

** (WT Astbury. Postępy rentgenowskiej analizy struktur organicznych i włóknistych.- Przyroda,. 1946, t. 157, 121.)

*** (WT Astbury. Przygody w biologii molekularnej . Thomas Springfield, 1952, s. 3.)

Biologia molekularna miała i stoi w istocie przed tymi samymi zadaniami, co biologia jako całość - poznanie istoty życia i jego podstawowych zjawisk, w szczególności takich jak dziedziczność i zmienność. Współczesna biologia molekularna ma przede wszystkim na celu rozszyfrowanie struktury i funkcji genów, sposobów i mechanizmów realizacji informacji genetycznej organizmów na różnych etapach ontogenezy i na różnych etapach jej odczytywania. Ma na celu ujawnienie subtelnych mechanizmów regulacji aktywności genów i różnicowania komórek, wyjaśnienie natury mutagenezy i molekularnych podstaw procesu ewolucyjnego.

Ustalenie genetycznej roli kwasów nukleinowych

Dla rozwoju biologii molekularnej największe znaczenie miały następujące odkrycia. W 1944 roku amerykańscy badacze O. Avery, K. McLeod (Nagroda Nobla, 1923) i M. McCarthy wykazali, że cząsteczki DNA wyizolowane z pneumokoków mają działanie transformujące. Po hydrolizie tych DNA przez dezoksyrybonukleazę, ich aktywność transformująca całkowicie zanikła. Tym samym po raz pierwszy przekonująco udowodniono, że to DNA, a nie białko, jest wyposażone w funkcje genetyczne w komórce.

Gwoli sprawiedliwości należy zauważyć, że zjawisko transformacji bakteryjnej zostało odkryte znacznie wcześniej niż odkrycie Avery'ego, McLeoda i McCarthy'ego. W 1928 roku F. Griffith opublikował artykuł, w którym poinformował, że po dodaniu zabitych komórek zamkniętego wirulentnego szczepu do niezjadliwych (nieotoczkowanych) pneumokoków, powstała mieszanina komórek staje się śmiertelna dla myszy. Co więcej, żywe komórki pneumokoków izolowane od zwierząt zakażonych tą mieszaniną były już zjadliwe i posiadały otoczkę polisacharydową. Tak więc w tym eksperymencie wykazano, że pod wpływem niektórych składników uśmierconych komórek pneumokoków, nieotoczkowa postać bakterii zamienia się w zjadliwą formę tworzącą kapsułki. Szesnaście lat później Avery, McLeod i McCarthy zastąpili w tym eksperymencie zabite całe komórki pneumokoków ich kwasem dezoksyrybonukleinowym i wykazali, że to DNA ma aktywność transformującą (patrz także rozdziały 7 i 25). Znaczenie tego odkrycia jest trudne do przecenienia. Pobudziło to badania kwasów nukleinowych w wielu laboratoriach na całym świecie i zmusiło naukowców do skupienia się na DNA.

Wraz z odkryciem Avery'ego, McLeoda i McCarthy'ego na początku lat pięćdziesiątych zgromadzono już dość dużą liczbę bezpośrednich i pośrednich dowodów na to, że kwasy nukleinowe odgrywają wyjątkową rolę w życiu i pełnią funkcję genetyczną. Wskazują na to w szczególności charakter lokalizacji DNA w komórce oraz dane R. Vendrelli (1948), że zawartość DNA w komórce jest ściśle stała i koreluje ze stopniem ploidii: w haploidalnych komórkach rozrodczych DNA jest połowę tego w diploidalnych komórkach somatycznych. Wyraźna stabilność metaboliczna DNA również świadczyła na korzyść genetycznej roli DNA. Na początku lat pięćdziesiątych zgromadzono wiele różnych faktów wskazujących, że większość znanych czynników mutagennych działa głównie na kwasy nukleinowe, aw szczególności na DNA (R. Hotchkiss, 1949; G. Ephrussi-Taylor, 1951; E. Freese, 1957 i inni).

Szczególnie ważne w ustaleniu genetycznej roli kwasów nukleinowych było badanie różnych fagów i wirusów. W 1933 r. D. Schlesinger znalazł DNA w bakteriofagach Escherichia coli. Od czasu wyizolowania wirusa mozaiki tytoniu (TMV) w stanie krystalicznym przez W. Stanleya (1935, Nagroda Nobla, 1946) rozpoczął się nowy etap w badaniach wirusów roślinnych. W latach 1937 - 1938. pracownicy Rothamsted Agricultural Station (Anglia) F. Bowden i N. Peary wykazali, że wiele wyizolowanych przez nich wirusów roślinnych nie jest globulinami, ale rybonukleoproteinami i zawiera kwas nukleinowy jako obowiązkowy składnik. Na samym początku lat 40. opublikowano prace G. Schramma (1940), P. A. Agatova (1941), G. Millera i W. Stanleya (1941), wskazujące, że zauważalna modyfikacja chemiczna składnika białkowego nie prowadzi do do utraty zakaźności TMV. Wskazywało to, że składnik białkowy nie mógł być nośnikiem dziedzicznych właściwości wirusa, jak nadal wierzyło wielu mikrobiologów. Przekonujące dowody przemawiające za genetyczną rolą kwasu nukleinowego (RNA) w wirusach roślinnych uzyskali w 1956 r. G. Schramm w Tybindze (RFN) i H. Frenkel-Konrath w Kalifornii (USA). Badacze ci prawie jednocześnie i niezależnie od siebie wyizolowali RNA z TMV i wykazali, że to ono, a nie białko, ma zakaźność: w wyniku zakażenia roślin tytoniu tym RNA powstały i namnożyły się w nich normalne cząsteczki wirusowe. Oznaczało to, że RNA zawierało informacje potrzebne do syntezy i składania wszystkich składników wirusowych, w tym białka wirusowego. W 1968 roku I. G. Atabekov ustalił, że białko odgrywa znaczącą rolę w samej infekcji roślin - charakter białka determinuje spektrum roślin żywicielskich.

W 1957 roku Frenkel-Konrat po raz pierwszy przeprowadził rekonstrukcję TMV z jego składników składowych - RNA i białka. Wraz z normalnymi cząsteczkami otrzymał mieszane „hybrydy”, w których RNA pochodziło z jednego szczepu, a białko z drugiego. Dziedziczność takich hybryd była całkowicie zdeterminowana przez RNA, a potomstwo wirusów należało do szczepu, którego RNA użyto do uzyskania początkowych mieszanych cząstek. Późniejsze eksperymenty A. Gierera, G. Schustera i G. Schramma (1958) oraz G. Witmana (1960 - 1966) wykazały, że chemiczna modyfikacja składnika nukleinowego TMV prowadzi do pojawienia się różnych mutantów tego wirusa.

W 1970 roku D. Baltimore i G. Temin odkryli, że transfer informacji genetycznej może zachodzić nie tylko z DNA na RNA, ale odwrotnie. W niektórych onkogennych wirusach zawierających RNA (onkornawirusy) znaleźli specjalny enzym, tak zwaną odwrotną transkryptazę, która jest zdolna do syntezy komplementarnego DNA na łańcuchach RNA. To ważne odkrycie umożliwiło zrozumienie mechanizmu wstawiania informacji genetycznej wirusów zawierających RNA do genomu gospodarza i świeże spojrzenie na naturę ich działania onkogennego.

Odkrycie kwasów nukleinowych i badanie ich właściwości

Termin kwasy nukleinowe wprowadził niemiecki biochemik R. Altman w 1889 r., po odkryciu tych związków w 1869 r. przez szwajcarskiego lekarza F. Mieschera. Misher przez kilka tygodni ekstrahował komórki ropne rozcieńczonym kwasem chlorowodorowym, aw pozostałej części uzyskał prawie czysty materiał jądrowy. Uznał ten materiał za charakterystyczną „substancję jąder komórkowych i nazwał go nukleiną. Nukleina swymi właściwościami znacznie różniła się od białek: była bardziej kwaśna, nie zawierała siarki, ale zawierała dużo fosforu, była łatwo rozpuszczalna w zasadach, ale nie rozpuszcza się w rozcieńczonych kwasach.

Misher przesłał wyniki swoich obserwacji dotyczących nukleiny F. Goppe-Seylerowi do publikacji w czasopiśmie. Opisana przez niego substancja była tak niezwykła (w tamtym czasie ze wszystkich biologicznych związków zawierających fosfor znana była tylko lecytyna), że Goppe-Seyler nie uwierzył w eksperymenty Misher, zwrócił mu rękopis i poinstruował swoich pracowników N. Plosh i N. Lyubavin, aby sprawdź jego wnioski na innym materiale. Praca Mieschera „O składzie chemicznym komórek ropnych” została opublikowana dwa lata później (1871). W tym samym czasie opublikowano prace Goppe-Seylera i jego współpracowników dotyczące składu komórek ropnych, erytrocytów ptaków, węży i ​​innych komórek. W ciągu następnych trzech lat nukleinę wyizolowano z komórek zwierzęcych i drożdży.

W swojej pracy Misher zauważył, że szczegółowe badanie różnych nuklein może doprowadzić do ustalenia różnic między nimi, wyprzedzając w ten sposób ideę specyficzności kwasów nukleinowych. Badając mleko łososia, Misher odkrył, że zawarta w nim nukleina ma postać soli i jest związana z głównym białkiem, które nazwał protaminą.

W 1879 r. A. Kossel rozpoczął badanie nuklein w laboratorium Goppe-Seylera. W 1881 roku wyizolował hipoksantynę z nukleiny, ale wtedy jeszcze wątpił w pochodzenie tej zasady i uważał, że hipoksantyna może być produktem degradacji białek. W 1891 r. wśród produktów hydrolizy nuklein Kossel odkrył adeninę, guaninę, kwas fosforowy i inną substancję o właściwościach cukru. Za badania nad chemią kwasów nukleinowych Kossel otrzymał Nagrodę Nobla w 1910 roku.

Dalszy postęp w rozszyfrowywaniu struktury kwasów nukleinowych wiąże się z badaniami P. Levina i współpracowników (1911 - 1934). W 1911 roku P. Levin i V. Jacobs zidentyfikowali węglowodanowy składnik adenozyny i guanozyny; odkryli, że te nukleozydy zawierają D-rybozę. W 1930 Lewin wykazał, że węglowodanowym składnikiem dezoksyrybonukleozydów jest 2-dezoksy-D-ryboza. Z jego prac wyszło, że kwasy nukleinowe zbudowane są z nukleotydów, czyli fosforylowanych nukleozydów. Levin uważał, że głównym rodzajem wiązania w kwasach nukleinowych (RNA) jest 2", 5" wiązanie fosfodiestrowe. Pogląd ten okazał się błędny. Dzięki pracom angielskiego chemika A. Todda (Nagroda Nobla, 1957) i jego współpracowników, a także angielskich biochemików R. Markhama i J. Smitha, na początku lat 50. stało się wiadome, że głównym typem wiązań w RNA to 3", 5" - wiązanie fosfodiestrowe.

Lewin wykazał, że różne kwasy nukleinowe mogą różnić się charakterem składnika węglowodanowego: niektóre z nich zawierają cukier dezoksyrybozę, podczas gdy inne zawierają rybozę. Ponadto te dwa rodzaje kwasów nukleinowych różniły się charakterem jednej z zasad: kwasy nukleinowe typu pentozy zawierały uracyl, a kwasy nukleinowe typu dezoksypentozy zawierały tyminę. Kwas dezoksypentozowy (we współczesnej terminologii kwas dezoksyrybonukleinowy - DNA) był zazwyczaj łatwo izolowany w dużych ilościach z grasicy (gruczołu słodkiego) cieląt. Dlatego nazwano go kwasem tymonukleinowym. Źródłem kwasu nukleinowego typu pentozowego (RNA) były głównie drożdże i kiełki pszenicy. Ten typ był często określany jako drożdżowy kwas nukleinowy.

Na początku lat trzydziestych XX wieku dość mocno zakorzeniony był pogląd, że komórki roślinne charakteryzują się drożdżowym kwasem nukleinowym, podczas gdy kwas tymonukleinowy był charakterystyczny tylko dla jąder komórek zwierzęcych. Dwa rodzaje kwasów nukleinowych, RNA i DNA, nazwano wówczas odpowiednio roślinnymi i zwierzęcymi kwasami nukleinowymi. Jednak, jak wykazały wczesne badania A. N. Belozersky'ego, taki podział kwasów nukleinowych jest nieuzasadniony. W 1934 roku Belozersky po raz pierwszy odkrył kwas tymonukleinowy w komórkach roślinnych: z sadzonek grochu wyizolował i zidentyfikował zasadę tymino-pirymidynową, która jest charakterystyczna dla DNA. Potem odkrył tyminę w innych roślinach (nasiona soi, fasoli). W 1936 roku AN Belozersky i I. I. Dubrovskaya preparatywnie wyizolowali DNA z sadzonek kasztanowca. Ponadto seria badań przeprowadzonych w Anglii w latach czterdziestych XX wieku przez D. Davidsona i współpracowników w przekonujący sposób wykazała, że ​​roślinny kwas nukleinowy (RNA) jest zawarty w wielu komórkach zwierzęcych.

Powszechne zastosowanie reakcji cytochemicznej na DNA opracowanej przez R. Felgena i G. Rosenbecka (1924) oraz reakcji J. Bracheta (1944) na RNA umożliwiło szybkie i jednoznaczne rozstrzygnięcie kwestii preferencyjnej lokalizacji tych kwasy w komórce. Okazało się, że DNA jest skoncentrowane w jądrze, podczas gdy RNA jest skoncentrowane głównie w cytoplazmie. Później stwierdzono, że RNA jest zawarte zarówno w cytoplazmie, jak iw jądrze, a ponadto zidentyfikowano cytoplazmatyczny DNA.

Jeśli chodzi o kwestię pierwotnej struktury kwasów nukleinowych, do połowy lat czterdziestych XX wieku idea P. Levina została mocno ugruntowana w nauce, zgodnie z którą wszystkie kwasy nukleinowe są zbudowane według tego samego typu i składają się z tego samego tzw. tetranukleotydu Bloki. Każdy z tych bloków, według Lewina, zawiera cztery różne nukleotydy. Tetranukleotydowa teoria budowy kwasów nukleinowych w dużej mierze pozbawiła te biopolimery specyficzności. Nic więc dziwnego, że w tamtym czasie cała specyfika żywych istot była związana tylko z białkami, których natura monomerów jest znacznie bardziej zróżnicowana (20 aminokwasów).

Pierwszą lukę w teorii struktury tetranukleotydowej kwasów nukleinowych dokonały dane analityczne angielskiego chemika J. Goulanda (1945 - 1947). Określając skład kwasów nukleinowych za pomocą azotu zasadowego, nie uzyskał równomolowego stosunku zasad, jak powinien być według teorii Lewina. Ostatecznie tetranukleotydowa teoria budowy kwasów nukleinowych upadła w wyniku badań E. Chargaffa i jego współpracowników (1949 - 1951). Chargaff zastosował chromatografię bibułową do oddzielenia zasad uwolnionych z DNA w wyniku jego kwaśnej hydrolizy. Każdą z tych zasad dokładnie określono spektrofotometrycznie. Chargaff zauważył znaczne odchylenia od równomolowego stosunku zasad w DNA różnego pochodzenia i po raz pierwszy zdecydowanie stwierdził, że DNA ma wyraźną specyficzność gatunkową. To zakończyło hegemonię koncepcji specyficzności białka w żywej komórce. Analizując DNA różnego pochodzenia, Chargaff odkrył i sformułował unikalne wzorce składu DNA, które weszły do ​​nauki pod nazwą reguł Chargaffa. Zgodnie z tymi regułami w każdym DNA, niezależnie od pochodzenia, ilość adeniny jest równa ilości tyminy (A = T), ilość guaniny jest równa ilości cytozyny (G = C), ilość puryn jest równa ilości pirymidyn (G + A = C + T), ilość zasad z grupami 6-aminowymi jest równa liczbie zasad z grupami 6-keto (A + C = G + T). Jednocześnie, pomimo tak ścisłej zgodności ilościowej, DNA różnych gatunków różni się wartością stosunku A+T:G+C. W niektórych DNA ilość guaniny i cytozyny przeważa nad ilością adeniny i tyminy (Chargaff nazwał te DNA DNA typu GC); inne DNA zawierały więcej adeniny i tyminy niż guaniny i cytozyny (te DNA były nazywane DNA typu AT). Uzyskane przez Chargaffa dane dotyczące składu DNA odegrały wyjątkową rolę w biologii molekularnej. To one stały się podstawą odkrycia struktury DNA, dokonanego w 1953 roku przez J. Watsona i F. Cricka.

Już w 1938 roku W. Astbury i F. Bell za pomocą analizy dyfrakcji rentgenowskiej wykazali, że płaszczyzny podstawowe w DNA powinny być prostopadłe do długiej osi cząsteczki i przypominać niejako stos płytek leżących na wierzchu od siebie. Wraz z udoskonaleniem techniki rentgenowskiej analizy dyfrakcyjnej, do lat 1952 - 1953. zgromadził informacje, które pozwoliły ocenić długość poszczególnych wiązań i kąty nachylenia. Umożliwiło to przedstawienie z największym prawdopodobieństwem natury orientacji pierścieni reszt pentozowych w szkielecie cukrowo-fosforanowym cząsteczki DNA. W 1952 roku S. Farberg zaproponował dwa spekulatywne modele DNA, które przedstawiały jednoniciową cząsteczkę zwiniętą lub skręconą na sobie. Nie mniej spekulatywny model budowy DNA zaproponowali w 1953 roku L. Pauling (laureat Nagrody Nobla, 1954) i R. Corey. W tym modelu trzy skręcone nici DNA tworzyły długą helisę, której rdzeń reprezentowały grupy fosforanowe, a zasady znajdowały się poza nią. Do 1953 roku M. Wilkins i R. Franklin uzyskali wyraźniejsze wzory dyfrakcji rentgenowskiej DNA. Ich analiza wykazała całkowitą porażkę modeli Farberga, Paulinga i Coreya. Wykorzystując dane Chargaffa, porównując różne kombinacje modeli molekularnych poszczególnych monomerów i dane z dyfrakcji rentgenowskiej, J. Watson i F. Crick w 1953 roku doszli do wniosku, że cząsteczka DNA musi być dwuniciową helisą. Reguły Chargaffa poważnie ograniczyły liczbę możliwych uporządkowanych kombinacji zasad w proponowanym modelu DNA; zasugerowali Watsonowi i Crickowi, że w cząsteczce DNA musi istnieć specyficzna para zasad - adenina z tyminą i guanina z cytozyną. Innymi słowy, adenina w jednej nici DNA zawsze ściśle odpowiada tyminie w drugiej nici, a guanina w jednej nici koniecznie odpowiada cytozynie w drugiej. Tak więc Watson i Crick jako pierwsi sformułowali niezwykle ważną zasadę komplementarności struktury DNA, zgodnie z którą jedna nić DNA uzupełnia drugą, tj. sekwencja zasad jednej nici jednoznacznie określa sekwencję zasad drugiej (komplementarnej) nici . Stało się oczywiste, że już w samej strukturze DNA tkwi potencjał jego dokładnej reprodukcji. Ten model struktury DNA jest obecnie powszechnie akceptowany. Crick, Watson i Wilkins otrzymali Nagrodę Nobla w 1962 roku za rozszyfrowanie struktury DNA.

Należy zauważyć, że idea mechanizmu dokładnego odtwarzania makrocząsteczek i przekazywania informacji dziedzicznej zrodziła się w naszym kraju. W 1927 roku NK Koltsov zasugerował, że podczas reprodukcji komórek reprodukcja cząsteczek zachodzi poprzez dokładną reprodukcję autokatalityczną istniejących cząsteczek macierzystych. To prawda, że ​​\u200b\u200bw tym czasie Kolcow nadał tej właściwości nie cząsteczkom DNA, ale cząsteczkom o charakterze białkowym, których znaczenie funkcjonalne było wówczas nieznane. Niemniej sama idea autokatalitycznej reprodukcji makrocząsteczek i mechanizmu przekazywania właściwości dziedzicznych okazała się prorocza: stała się myślą przewodnią współczesnej biologii molekularnej.

Przeprowadzone w laboratorium A. N. Belozersky'ego przez A. S. Spirina, G. N. Zaitsevy, B. F. Vanyushina, S. O. Urysona, A. S. Antonova i innych różnorodność organizmów w pełni potwierdziła wzorce odkryte przez Chargaffa i pełną zgodność z molekularnym modelem struktury DNA zaproponowanym przez Watsona i Cricka. Badania te wykazały, że DNA różnych bakterii, grzybów, glonów, promieniowców, roślin wyższych, bezkręgowców i kręgowców ma specyficzny skład. Różnice w składzie (zawartość par zasad AT) są szczególnie wyraźne u mikroorganizmów, okazując się ważną cechą taksonomiczną. U roślin wyższych i zwierząt różnice gatunkowe w składzie DNA są znacznie mniej wyraźne. Nie oznacza to jednak, że ich DNA jest mniej specyficzne. Oprócz składu zasad, specyficzność w dużej mierze zależy od ich sekwencji w łańcuchach DNA.

Oprócz zwykłych zasad w DNA i RNA znaleziono dodatkowe zasady azotowe. Tak więc G. White (1950) znalazł 5-metylocytozynę w DNA roślin i zwierząt, a D. Dunn i J. Smith (1958) znaleźli metylowaną adeninę w pewnym DNA. Przez długi czas metylocytozyna była uważana za cechę charakterystyczną materiału genetycznego organizmów wyższych. W 1968 roku AN Belozersky, BF Vanyushin i NA Kokurina odkryli, że można go również znaleźć w DNA bakterii.

W 1964 roku M. Gold i J. Hurwitz odkryli nową klasę enzymów, które dokonują naturalnej modyfikacji DNA - jego metylacji. Po tym odkryciu stało się jasne, że drugorzędne (zawarte w niewielkich ilościach) zasady powstają już na gotowym łańcuchu polinukleotydowym DNA w wyniku specyficznej metylacji reszt cytozyny i adeniny w specjalnych sekwencjach. W szczególności, według B. F. Vanyushin, Ya. I. Buryanov i A. N. Belozersky (1969), metylacja adeniny w DNA E. coli może zachodzić w kodonach kończących. Według A. N. Belozersky'ego i współpracowników (1968 - 1970), a także M. Meselsona (USA) i V. Arbera (Szwajcaria) (1965 - 1969), metylacja nadaje cząsteczkom DNA unikalne indywidualne cechy i w połączeniu z działaniem specyficzne nukleazy, jest częścią złożonego mechanizmu kontrolującego syntezę DNA w komórce. Innymi słowy, charakter metylacji konkretnego DNA przesądza o tym, czy może się on namnażać w danej komórce.

Niemal w tym samym czasie rozpoczęto izolację i intensywne badania metylaz DNA i endonukleaz restrykcyjnych; w latach 1969 - 1975 ustalono sekwencje nukleotydów rozpoznawane w DNA przez niektóre z tych enzymów (X. Boyer, X. Smith, S. Lynn, K. Murray). Kiedy różne DNA są hydrolizowane przez enzym restrykcyjny, odcinane są raczej duże fragmenty z identycznymi „lepkimi” końcami. Umożliwia to nie tylko analizę struktury genów, jak to ma miejsce w przypadku małych wirusów (D. Nathans, S. Adler, 1973 - 1975), ale także konstruowanie różnych genomów. Wraz z odkryciem tych specyficznych enzymów restrykcyjnych inżynieria genetyczna stała się namacalną rzeczywistością. Osadzone w małym plazmidowym DNA geny różnego pochodzenia są już łatwo wprowadzane do różnych komórek. Otrzymano więc nowy typ biologicznie aktywnych plazmidów, dających oporność na niektóre antybiotyki (S. Cohen, 1973), wprowadzono geny rybosomalne żaby i Drosophila do plazmidów Escherichia coli (J. Morrow, 1974; X. Boyer, D. Hogness, R. Davis, 1974-1975). W ten sposób otwierają się rzeczywiste drogi uzyskiwania zasadniczo nowych organizmów poprzez wprowadzanie i integrowanie różnych genów do ich puli genowej. To odkrycie może być skierowane na korzyść całej ludzkości.

W 1952 roku G. White i S. Cohen odkryli, że DNA fagów T-even zawiera niezwykłą zasadę - 5-hydroksymetylocytozynę. Później z prac E. Volkina i R. Sinsheimera (1954) oraz Cohena (1956) okazało się, że reszty hydroksymetylocytozyny mogą być całkowicie lub częściowo glukozydowane, w wyniku czego cząsteczka DNA faga jest chroniona przed działaniem hydrolitycznym nukleaz.

Na początku lat 50. z prac D. Dunna i J. Smitha (Anglia), S. Zamenhofa (USA) i A. Wackera (Niemcy) wyszło na jaw, że w DNA można włączyć wiele sztucznych analogów zasad, czasem zastępując do 50% tyminy. Z reguły substytucje te prowadzą do błędów w replikacji, transkrypcji i translacji DNA oraz do pojawienia się mutantów. Tak więc J. Marmur (1962) stwierdził, że DNA niektórych fagów zawiera oksymetylouracyl zamiast tyminy. W 1963 roku I. Takahashi i J. Marmur odkryli, że DNA jednego z fagów zawiera uracyl zamiast tyminy. Tym samym upadła kolejna zasada, według której wcześniej rozdzielano kwasy nukleinowe. Od czasów P. Levina uważano, że tymina jest cechą charakterystyczną DNA, a uracyl cechą charakterystyczną RNA. Stało się jasne, że znak ten nie zawsze jest wiarygodny, a zasadniczą różnicą w naturze chemicznej obu rodzajów kwasów nukleinowych, jak się dziś wydaje, jest jedynie charakter składnika węglowodanowego.

W badaniach fagów odkryto wiele niezwykłych cech organizacji kwasów nukleinowych. Od 1953 roku uważa się, że wszystkie DNA są dwuniciowymi liniowymi cząsteczkami, podczas gdy RNA jest tylko jednoniciowy. Stanowisko to uległo znacznemu zachwianiu w 1961 r., kiedy R. Sinsheimer odkrył, że DNA faga φ X 174 jest reprezentowane przez jednoniciową kolistą cząsteczkę. Jednak później okazało się, że w tej postaci to DNA istnieje tylko w cząsteczce faga wegetatywnego, a forma replikacyjna DNA tego faga jest również dwuniciowa. Ponadto okazało się dość nieoczekiwane, że RNA niektórych wirusów może być dwuniciowy. Ten nowy typ makrocząsteczkowej organizacji RNA został odkryty w 1962 roku przez P. Gomatosa, I. Tamma i innych badaczy niektórych wirusów zwierzęcych i wirusa nowotworów ran roślinnych. Ostatnio V. I. Agol i A. A. Bogdanov (1970) ustalili, że oprócz liniowych cząsteczek RNA istnieją również cząsteczki zamknięte lub cykliczne. Wykryli cykliczne dwuniciowe RNA, w szczególności w wirusie zapalenia mózgu i rdzenia sercowego. Dzięki pracom X. Deveaux, L. Tinoko, T. I. Tichonenko, E. I. Budovsky'ego i innych (1960 - 1974) poznano główne cechy organizacji (układania) materiału genetycznego w bakteriofagach.

Pod koniec lat pięćdziesiątych amerykański naukowiec P. Doty odkrył, że ogrzewanie powoduje denaturację DNA, której towarzyszy zerwanie wiązań wodorowych między parami zasad i rozdzielenie łańcuchów komplementarnych. Proces ten ma charakter przejścia fazowego „spiral-cewka” i przypomina topienie kryształów. Dlatego Doty nazwał proces termicznej denaturacji DNA topnieniem DNA. Przy powolnym chłodzeniu następuje renaturacja cząsteczek, czyli ponowne połączenie uzupełniających się połówek.

Zasadę renaturacji w 1960 roku wykorzystali J. Marmur i K. Schildkraut do określenia stopnia „hybrydyzowalności” DNA różnych mikroorganizmów. Następnie E. Bolton i B. McCarthy udoskonalili tę technikę, proponując metodę tzw. kolumn DNA-agar. Metoda ta okazała się niezbędna do badania stopnia homologii sekwencji nukleotydów różnych DNA i wyjaśniania pokrewieństwa genetycznego różnych organizmów. Denaturacja DNA odkryta przez Doty'ego w połączeniu z chromatografią na metylowanej albuminie opisaną przez J. Mandela i A. Hersheya* (1960) oraz wirowanie w gradiencie gęstości (metodę opracowali w 1957 roku M. Meselson, F. Stahl i D. Winograd) jest szeroko stosowany do separacji, izolacji i analizy poszczególnych komplementarnych nici DNA. Na przykład W. Shibalsky (USA), stosując te techniki do rozdzielania DNA faga lambda, wykazał w latach 1967 - 1969, że oba łańcuchy faga są genetycznie aktywny, a nie jeden, jak to uważano (S. Spiegelman, 1961). Należy zauważyć, że po raz pierwszy idea genetycznego znaczenia obu nici DNA faga lambda została wyrażona w ZSRR przez SE Breslera (1961).

* (Za prace nad genetyką bakterii i wirusów A. Hershey wraz z M. Delbrückiem i S. Lurią otrzymali w 1969 roku Nagrodę Nobla.)

Aby zrozumieć organizację i aktywność funkcjonalną genomu, określenie sekwencji nukleotydów DNA ma ogromne znaczenie. Poszukiwania metod takiego oznaczania prowadzone są w wielu laboratoriach na całym świecie. Od końca lat pięćdziesiątych M. Beer i jego współpracownicy próbują ustalić sekwencję DNA za pomocą mikroskopii elektronowej w USA, ale jak dotąd bez powodzenia. Na początku lat pięćdziesiątych XX wieku, z pierwszych prac Sinsheimera, Chargaffa i innych badaczy dotyczących enzymatycznej degradacji DNA, stało się wiadome, że różne nukleotydy w cząsteczce DNA są rozmieszczone, chociaż nie losowo, ale nierównomiernie. Według angielskiego chemika C. Bartona (1961) pirymidyny (ponad 70%) są skoncentrowane głównie w postaci odpowiednich bloków. A. L. Mazin i B. F. Vanyushin (1968 - 1969) stwierdzili, że różne DNA mają różne stopnie spójności pirymidynowej i że w DNA organizmów zwierzęcych zwiększa się ona znacznie w miarę przesuwania się od niższego do wyższego. Tak więc ewolucja organizmów znajduje odzwierciedlenie również w strukturze ich genomów. Dlatego dla zrozumienia procesu ewolucyjnego jako całości szczególne znaczenie mają badania porównawcze struktury kwasów nukleinowych. Analiza budowy ważnych biologicznie polimerów, a przede wszystkim DNA jest niezwykle ważna dla rozwiązania wielu szczegółowych problemów filogenetyki i taksonomii.

Warto zauważyć, że angielski fizjolog E. Lankester, który badał hemoglobiny mięczaków, antycypował idee biologii molekularnej dokładnie 100 lat temu, napisał: „Różnice chemiczne między różnymi gatunkami i rodzajami zwierząt i roślin są równie ważne dla wyjaśnienia historia ich powstania jako ich forma.Gdybyśmy potrafili jasno ustalić różnice w organizacji molekularnej i funkcjonowaniu organizmów, bylibyśmy w stanie zrozumieć pochodzenie i ewolucję różnych organizmów znacznie lepiej niż na podstawie obserwacji morfologicznych" * . Znaczenie badań biochemicznych dla taksonomii podkreślał także VL Komarow, który napisał, że „podstawą wszystkich nawet czysto morfologicznych cech, na podstawie których klasyfikujemy i ustalamy gatunki, są właśnie różnice biochemiczne”**.

* (ER Lankester. Uber das Vorcommen von Hemoglobin in den Muskeln der Mollusken und die Verbreitung desselben in den lebendigen Organismen.- "Pfluger" s Archiv fur die gesammte Physiol., 1871, Bd 4, 319.)

** (VL Komarow. Wybrane prace, t. 1. M.-L., Wydawnictwo Akademii Nauk ZSRR, 1945, s. 331.)

A. V. Blagoveshchenskii i S. L. Ivanov już w latach dwudziestych XX wieku podjęli w naszym kraju pierwsze kroki w celu wyjaśnienia pewnych kwestii dotyczących ewolucji i systematyki organizmów na podstawie analizy porównawczej ich składu biochemicznego (patrz rozdział 2). Analiza porównawcza struktury białek i kwasów nukleinowych staje się obecnie coraz bardziej namacalnym narzędziem dla taksonomów (patrz rozdział 21). Ta metoda biologii molekularnej pozwala nie tylko doprecyzować pozycję poszczególnych gatunków w systemie, ale także powoduje konieczność świeżego spojrzenia na same zasady klasyfikacji organizmów, a czasem rewizję całego systemu jako całości, jak np. stało się na przykład z systematyką mikroorganizmów. Niewątpliwie w przyszłości analiza struktury genomu zajmie centralne miejsce w chemosystematyce organizmów.

Ogromne znaczenie dla rozwoju biologii molekularnej miało rozszyfrowanie mechanizmów replikacji i transkrypcji DNA (patrz rozdział 24).

Biosynteza białek

Ważny zwrot w rozwiązaniu problemu biosyntezy białek wiąże się z postępem w badaniach nad kwasami nukleinowymi. W 1941 r. T. Kasperson (Szwecja) iw 1942 r. J. Brachet (Belgia) zwrócili uwagę na fakt, że tkanki z aktywną syntezą białek zawierają zwiększoną ilość RNA. Doszli do wniosku, że kwasy rybonukleinowe odgrywają decydującą rolę w syntezie białek. Wydaje się, że w 1953 roku E. Gale i D. Fox otrzymali bezpośrednie dowody na bezpośredni udział RNA w biosyntezie białek: według ich danych rybonukleaza znacznie hamowała wbudowywanie aminokwasów w lizaty komórek bakteryjnych. Podobne dane uzyskali V. Olfri, M. Delhi i A. Mirsky (1953) na temat homogenatów wątroby. Później E. Gale odrzucił słuszną jego myśl o wiodącej roli RNA w syntezie białek, błędnie sądząc, że aktywacja syntezy białek w układzie bezkomórkowym nastąpiła pod wpływem jakiejś innej substancji o nieznanym charakterze. W 1954 r. P. Zamechnik, D. Littlefield, R. B. Khesin-Lurie i inni odkryli, że najbardziej aktywna inkorporacja aminokwasów występuje we frakcjach cząstek subkomórkowych bogatych w RNA - mikrosomach. P. Zamechnik i E. Keller (1953 - 1954) stwierdzili, że włączanie aminokwasów było zauważalnie zwiększone w obecności supernatantu w warunkach regeneracji ATP. P. Sikevitz (1952) i M. Hoagland (1956) wyizolowali z supernatantu frakcję białkową (frakcja o pH 5), która była odpowiedzialna za ostrą stymulację inkluzji aminokwasów w mikrosomach. Wraz z białkami w supernatancie znaleziono specjalną klasę RNA o niskiej masie cząsteczkowej, obecnie nazywaną transferowym RNA (tRNA). W 1958 roku Hoagland i Zamechnik, a także P. Berg, R. Sweet i F. Allen oraz wielu innych badaczy odkryli, że każdy aminokwas wymaga do aktywacji własnego specjalnego enzymu, ATP i specyficznego tRNA. Stało się jasne, że tRNA pełnią wyłącznie funkcję adapterów, czyli urządzeń, które znajdują miejsce na macierzy nukleinowej (mRNA) dla odpowiedniego aminokwasu w powstającej cząsteczce białka. Badania te w pełni potwierdziły hipotezę adaptera F. Cricka (1957), która przewidywała istnienie w komórce adapterów polinukleotydowych niezbędnych do prawidłowego ułożenia reszt aminokwasowych syntetyzowanego białka na macierzy nukleinowej. Znacznie później francuski naukowiec F. Chapville (1962) w laboratorium F. Lipmana (Nagroda Nobla, 1953) w USA bardzo pomysłowo i jednoznacznie wykazał, że położenie aminokwasu w syntetyzowanej cząsteczce białka jest całkowicie zdeterminowane przez specyficznego tRNA, do którego jest przyłączony. Hipoteza adaptera Cricka została opracowana przez Hoaglanda i Zamechnika.

Do 1958 roku znane były następujące główne etapy syntezy białek: 1) aktywacja aminokwasu przez określony enzym z „frakcji pH 5” w obecności ATP z utworzeniem adenylanu aminoacylu; 2) przyłączenie aktywowanego aminokwasu do określonego tRNA z uwolnieniem monofosforanu adenozyny (AMP); 3) wiązanie aminoacylo-tRNA (tRNA obciążonego aminokwasem) do mikrosomów i włączanie aminokwasów do białka z uwolnieniem tRNA. Hoagland (1958) zauważył, że trójfosforan guanozyny (GTP) jest wymagany na ostatnim etapie syntezy białek.

Transfer RNA i synteza genów

Po odkryciu tRNA rozpoczęto aktywne poszukiwania ich frakcjonowania i określania sekwencji nukleotydów. Największy sukces odniósł amerykański biochemik R. Holly. W 1965 roku ustalił strukturę tRNA alaniny z drożdży. Za pomocą rybonukleaz (RNAzy guanylowej i RNazy trzustkowej) Holly podzieliła cząsteczkę kwasu nukleinowego na kilka fragmentów, w każdym z nich z osobna ustaliła sekwencję nukleotydów, a następnie zrekonstruowała sekwencję całej cząsteczki alaniny tRNA. Ten sposób analizy sekwencji nukleotydów nazywany jest metodą blokową. Zasługa Holly'ego polegała głównie na tym, że nauczył się dzielić cząsteczkę RNA nie tylko na małe kawałki, jak wielu przed nim, ale także na duże fragmenty (ćwiartki i połówki). Dało mu to możliwość prawidłowego złożenia pojedynczych małych kawałków razem, a tym samym odtworzenia kompletnej sekwencji nukleotydów całej cząsteczki tRNA (Nagroda Nobla, 1968).

Ta technika została natychmiast przyjęta przez wiele laboratoriów na całym świecie. W ciągu następnych dwóch lat rozszyfrowano pierwotną strukturę kilku tRNA w ZSRR i za granicą. AA Baev (1967) i współpracownicy po raz pierwszy ustalili sekwencję nukleotydów w tRNA waliny drożdży. Do tej pory zbadano kilkanaście różnych pojedynczych tRNA. Osobliwy zapis w określaniu sekwencji nukleotydów ustanowili w Cambridge F. Senger i G. Brownlee. Badacze ci opracowali zaskakująco elegancką metodę oddzielania oligonukleotydów i sekwencjonowania tak zwanego 5S (rybosomalnego) RNA z komórek E. coli (1968). Ten RNA składa się ze 120 reszt nukleotydowych i w przeciwieństwie do tRNA nie zawiera dodatkowych drugorzędnych zasad, co znacznie ułatwia analizę sekwencji nukleotydów, służąc jako unikalne punkty orientacyjne dla poszczególnych fragmentów cząsteczki. Obecnie, dzięki wykorzystaniu metody Sangera i Brownlee'a, w laboratorium J. Ebela (Francja) i innych badaczy z powodzeniem rozwijają się prace nad badaniem sekwencji długich rybosomalnych RNA i niektórych wirusowych RNA.

A. A. Baev i współpracownicy (1967) stwierdzili, że przecięte na pół tRNA waliny przywraca w roztworze swoją strukturę makrocząsteczkową i pomimo defektu w strukturze pierwszorzędowej wykazuje aktywność funkcjonalną pierwotnej (natywnej) cząsteczki. Takie podejście - rekonstrukcja pociętej makrocząsteczki po usunięciu pewnych fragmentów - okazało się bardzo obiecujące. Jest obecnie szeroko stosowany do wyjaśnienia funkcjonalnej roli poszczególnych odcinków niektórych tRNA.

W ostatnich latach osiągnięto duży sukces w otrzymywaniu krystalicznych preparatów poszczególnych tRNA. Wiele tRNA zostało już skrystalizowanych w kilku laboratoriach w USA i Anglii. Umożliwiło to badanie struktury tRNA za pomocą analizy dyfrakcji rentgenowskiej. W 1970 r. R. Bock przedstawił pierwsze wzory rentgenowskie i trójwymiarowe modele kilku tRNA, które stworzył na Uniwersytecie Wisconsin. Modele te pomagają określić lokalizację poszczególnych miejsc aktywnych funkcjonalnie w tRNA i zrozumieć podstawowe zasady funkcjonowania tych cząsteczek.

Pierwszorzędne znaczenie dla ujawnienia mechanizmu syntezy białek i rozwiązania problemu specyfiki tego procesu miało rozszyfrowanie natury kodu genetycznego (patrz rozdział 24), co bez przesady można uznać za wiodące osiągnięcie nauki przyrodnicze XX wieku.

Odkrycie przez R. Holly'ego pierwszorzędowej struktury tRNA dało impuls pracom G. Korany* (USA) nad syntezą oligonukleotydów i skierowało je w stronę syntezy określonej struktury biologicznej - cząsteczki DNA kodującej tRNA alaniny. Pierwsze kroki w chemicznej syntezie krótkich oligonukleotydów wykonane przez Koran prawie 15 lat temu osiągnęły punkt kulminacyjny w 1970 roku wraz z pierwszą syntezą genów. Koran i jego współpracownicy jako pierwsi zsyntetyzowali chemicznie krótkie fragmenty 8-12 reszt nukleotydowych z poszczególnych nukleotydów. Te fragmenty o danej sekwencji nukleotydów tworzyły spontanicznie dwuniciowe komplementarne fragmenty z nakładaniem się 4–5 nukleotydów. Następnie te gotowe kawałki zostały połączone od końca do końca we właściwej kolejności przy użyciu enzymu ligazy DNA. Tak więc, w przeciwieństwie do replikacji cząsteczek DNA, według A. Kornberga ** (patrz rozdział 24), w Koranie udało się odtworzyć naturalną dwuniciową cząsteczkę DNA zgodnie z wcześniej zaplanowanym programem zgodnie z sekwencja tRNA opisana przez Holly. Podobnie obecnie trwają prace nad syntezą innych genów (M. N. Kolosov, Z. A. Shabarova, D. G. Knorre, 1970 - 1975).

* (Za badanie kodu genetycznego G. Koran i M. Nirenberg otrzymali Nagrodę Nobla w 1968 roku.)

** (Za odkrycie polimerazy i syntezy DNA A. Kornberg, a za syntezę RNA S. Ochoa otrzymał w 1959 roku Nagrodę Nobla.)

Mikrosomy, rybosomy, translacja

W połowie lat pięćdziesiątych uważano, że mikrosomy są centrum syntezy białek w komórce. Termin mikrosomy został po raz pierwszy wprowadzony w 1949 roku przez A. Claude'a w odniesieniu do frakcji małych granulek. Później okazało się, że za syntezę białek odpowiada nie cała frakcja mikrosomów, złożona z błon i ziarnistości, a jedynie małe cząsteczki rybonukleoprotein. Cząstki te w 1958 r. zostały nazwane przez R. Robertsa rybosomami.

Klasyczne badania rybosomów bakteryjnych prowadzili A. Tisier i J. Watson w latach 1958-1959. Rybosomy bakteryjne okazały się nieco mniejsze niż rybosomy roślinne i zwierzęce. J. Littleton (1960), M. Clark (1964) i E. N. Svetailo (1966) wykazali, że rybosomy chloroplastów roślin wyższych i mitochondriów należą do typu bakteryjnego. A. Tisier i inni (1958) stwierdzili, że rybosomy dysocjują na dwie nierówne podjednostki zawierające po jednej cząsteczce RNA każda. Pod koniec lat 50. uważano, że każda cząsteczka rybosomalnego RNA składa się z kilku krótkich fragmentów. Jednak AS Spirin w 1960 roku jako pierwszy wykazał, że RNA w podcząstkach jest reprezentowane przez ciągłą cząsteczkę. D. Waller (1960), rozdzielając białka rybosomalne za pomocą elektroforezy w żelu skrobiowym, stwierdził, że są one bardzo niejednorodne. Początkowo wielu wątpiło w dane Wallera, ponieważ wydawało się, że białko rybosomu powinno być ściśle jednorodne, jak na przykład białko TMV. Obecnie, w wyniku badań D. Wallera, R. Trouta, P. Trauba i innych biochemików, okazało się, że skład rzeczywistych cząstek rybosomalnych obejmuje ponad 50 białek o zupełnie innej strukturze. AS Spirin w 1963 roku jako pierwszy rozwinął podcząstki rybosomów i wykazał, że rybosomy to zwarta skręcona nić rybonukleoproteinowa, która może się rozwijać w określonych warunkach. W latach 1967 - 1968 M. Nomura całkowicie zrekonstruował biologicznie aktywną podjednostkę z rybosomalnego RNA i białka, a nawet uzyskał rybosomy, w których białko i RNA należały do ​​różnych mikroorganizmów.

Rola rybosomalnego RNA jest nadal niejasna. Przyjmuje się, że jest to ta unikalna specyficzna macierz, na której podczas formowania cząsteczki rybosomu każde z licznych rybosomalnych białek znajduje ściśle określone miejsce (AS Spirin, 1968).

A. Rich (1962) odkrył agregaty kilku rybosomów połączonych ze sobą nicią mRNA. Kompleksy te nazwano polisomami. Odkrycie polisomów pozwoliło Richowi i Watsonowi (1963) zasugerować, że synteza łańcucha polipeptydowego zachodzi na rybosomie, który niejako porusza się wzdłuż łańcucha mRNA. Gdy rybosom porusza się wzdłuż łańcucha mRNA, informacja jest odczytywana w cząstce i tworzy się białkowy łańcuch polipeptydowy, a nowe rybosomy na przemian przyłączają się do uwolnionego odczytu końca mRNA. Z danych Richa i Watsona wynikało, że znaczenie polisomów w komórce polega na masowej produkcji białka poprzez sukcesywne odczytywanie matrycy przez kilka rybosomów naraz.

W wyniku badań M. Nirenberga, S. Ochoa, F. Lipmana, G. Korany i innych w latach 1963 - 1970. okazało się, że wraz z mRNA, rybosomami, ATP i aminoacylo-tRNA w procesie translacji bierze udział duża liczba różnych czynników, a sam proces translacji można warunkowo podzielić na trzy etapy - inicjację, samą translację i terminację.

Inicjacja translacji oznacza syntezę pierwszego wiązania peptydowego w kompleksie rybosom - polinukleotyd matrycowy - aminoacylo-tRNA. Taką aktywność inicjacyjną posiada nie jakikolwiek aminoacylo-tRNA, ale formylometionylo-tRNA. Substancja ta została po raz pierwszy wyizolowana w 1964 roku przez F. Sengera i K. Markera. S. Bretcher i K. Marker (1966) wykazali, że funkcja inicjacyjna formylometionylo-tRNA wynika z jego zwiększonego powinowactwa do centrum peptydylowego rybosomu. Dla rozpoczęcia translacji niezwykle ważne są również niektóre białkowe czynniki inicjujące, które zostały wyizolowane w laboratoriach S. Ochoa, F. Gro i innych ośrodków badawczych. Po utworzeniu pierwszego wiązania peptydowego w rybosomie rozpoczyna się sama translacja, czyli sekwencyjne dodawanie reszty aminoacylowej do C-końca polipeptydu. Wiele szczegółów procesu tłumaczenia przestudiowali K. Monroe i J. Bishop (Anglia), I. Rykhlik i F. Shorm (Czechosłowacja), F. Lipman, M. Bretcher, W. Gilbert (USA) i inni badacze. W 1968 roku AS Spirin zaproponował oryginalną hipotezę wyjaśniającą mechanizm rybosomu. Mechanizmem napędowym, który zapewnia wszystkie ruchy przestrzenne tRNA i mRNA podczas translacji, jest okresowe otwieranie i zamykanie subcząstek rybosomów. Terminacja translacji jest zakodowana w samej czytelnej macierzy, która zawiera kodony terminacji. Jak wykazał S. Brenner (1965 - 1967), takimi kodonami są trojaczki UAA, UAG i UGA. M. Capecci (1967) również zidentyfikował specjalne czynniki terminacji białek. AS Spirin i LP Gavrilova opisali tak zwaną „nieenzymatyczną” syntezę białek w rybosomach (1972 - 1975) bez udziału czynników białkowych. To odkrycie jest ważne dla zrozumienia pochodzenia i ewolucji biosyntezy białek.

Regulacja aktywności genów i białek

Po problemie specyficzności syntezy białek, na pierwszym miejscu w biologii molekularnej okazał się problem regulacji syntezy białek, a właściwie regulacji aktywności genów.

Funkcjonalna nierównowaga komórek oraz związana z nią represja i aktywacja genów od dawna przyciągają uwagę genetyków, ale do niedawna prawdziwy mechanizm kontrolowania aktywności genów pozostawał nieznany.

Pierwsze próby wyjaśnienia regulacyjnej aktywności genów związane były z badaniem białek histonowych. Nawet małżonkowie Steadmanów * na początku lat 40. XX wieku. zasugerowali, że główną rolę w tym zjawisku mogą odgrywać histony. Następnie uzyskali pierwsze jasne dane dotyczące różnic w naturze chemicznej białek histonowych. Obecnie z roku na rok przybywa faktów przemawiających za tą hipotezą.

* (E. Stedman, E. Stedman. Podstawowe białka jąder komórkowych.- Filozof. Trans. Roya. towarzyska Londyn, 1951, t. 235, 565 - 595.)

Jednocześnie gromadzi się coraz więcej danych wskazujących, że regulacja aktywności genów jest procesem znacznie bardziej złożonym niż prosta interakcja fragmentów genów z cząsteczkami białek histonowych. W latach 1960 - 1962 w laboratorium R. B. Khesin-Lurie stwierdzono, że geny faga zaczynają być odczytywane niejednocześnie: geny faga T2 można podzielić na geny wczesne, których funkcjonowanie nastąpiło w pierwszych minutach zakażenia komórki bakteryjnej i późnych, które zaczęły syntetyzować mRNA po zakończeniu pracy wczesnych genów.

W 1961 roku francuscy biochemicy F. Jacob i J. Monod zaproponowali schemat regulacji aktywności genów, który odegrał wyjątkową rolę w zrozumieniu mechanizmów regulacyjnych komórki w ogóle. Zgodnie ze schematem Jacoba i Monoda, oprócz genów strukturalnych (informacyjnych), DNA zawiera również geny-regulatory i geny-operatory. Gen regulatorowy koduje syntezę określonej substancji - represora, który może przyłączać się zarówno do genu indukującego, jak i do genu operatora. Gen operatora jest połączony z genami strukturalnymi, podczas gdy gen regulatorowy znajduje się w pewnej odległości od nich. Jeśli w środowisku nie ma induktora, na przykład laktozy, to represor syntetyzowany przez gen regulatorowy wiąże się z genem operatora i blokując go, wyłącza pracę całego operonu (blok genów strukturalnych wraz z operatorem który nimi steruje). Tworzenie enzymów nie zachodzi w tych warunkach. Jeśli w pożywce pojawi się induktor (laktoza), wówczas produkt genu regulatorowego, represor, wiąże się z laktozą i usuwa blokadę z genu operatora. W tym przypadku możliwa staje się praca genu strukturalnego kodującego syntezę enzymu iw pożywce pojawia się enzym (laktoza).

Według Jacoba i Monoda ten schemat regulacji ma zastosowanie do wszystkich enzymów adaptacyjnych i może mieć miejsce zarówno podczas represji, gdy powstawanie enzymu jest hamowane przez nadmiar produktu reakcji, jak i podczas indukcji, gdy wprowadzenie substratu powoduje synteza enzymu. Za badania nad regulacją aktywności genów Jacob i Monod otrzymali Nagrodę Nobla w 1965 roku.

Początkowo ten schemat wydawał się zbyt daleko idący. Jednak później okazało się, że regulacja genów według tej zasady zachodzi nie tylko u bakterii, ale także u innych organizmów.

Od 1960 roku ważne miejsce w biologii molekularnej zajmują badania organizacji genomu i struktury chromatyny w organizmach eukariotycznych (J. Bonner, R. Britten, W. Olfrey, P. Walker, Yu. S. Chentsov , I. B. Zbarsky i inni .) i regulacja transkrypcji (A. Mirsky, G. P. Georgiev, M. Bernstiel, D. Goll, R. Tsanev, R. I. Salganik). Przez długi czas natura represora pozostawała nieznana i kontrowersyjna. W 1968 r. M. Ptashne (USA) wykazał, że białko jest represorem. Wyizolował go w laboratorium J. Watsona i stwierdził, że represor rzeczywiście ma powinowactwo do induktora (laktozy) i jednocześnie „rozpoznaje” gen operatora operonu lac i specyficznie się z nim wiąże.

W ciągu ostatnich 5 - 7 lat uzyskano dane o obecności innej komórki kontrolnej aktywności genu - promotora. Okazało się, że obok miejsca operatorskiego, do którego przyłączony jest produkt syntetyzowany na regulatorze genu – substancja białkowa represora, istnieje jeszcze jedno miejsce, które również należy przypisać członkom systemu regulacyjnego genu. działalność. Do tego miejsca przyłączona jest cząsteczka białka enzymu polimerazy RNA. W regionie promotora musi zachodzić wzajemne rozpoznawanie unikalnej sekwencji nukleotydów w DNA i specyficznej konfiguracji białka polimerazy RNA. Realizacja procesu odczytywania informacji genetycznej z zadaną sekwencją genów operonu przylegającego do promotora będzie zależała od skuteczności rozpoznawania.

Oprócz schematu opisanego przez Jacoba i Monoda istnieją inne mechanizmy regulacji genów w komórce. F. Jacob i S. Brenner (1963) ustalili, że regulacja replikacji bakteryjnego DNA jest w pewien sposób kontrolowana przez błonę komórkową. Eksperymenty Jacoba (1954) dotyczące indukcji różnych profagów przekonująco wykazały, że pod wpływem różnych czynników mutagennych w komórce bakterii lizogennych rozpoczyna się selektywna replikacja genu profaga, a replikacja genomu gospodarza zostaje zablokowana. W 1970 roku F. Bell poinformował, że małe cząsteczki DNA mogą przechodzić z jądra do cytoplazmy i tam ulegać transkrypcji.

Tak więc aktywność genów może być regulowana na poziomie replikacji, transkrypcji i translacji.

Poczyniono znaczne postępy w badaniu regulacji nie tylko syntezy enzymów, ale także ich aktywności. A. Novik i L. Szilard zwrócili uwagę na zjawiska regulacji aktywności enzymów w komórce już w latach 50. XX wieku. G. Umbarger (1956) stwierdził, że w komórce istnieje bardzo racjonalny sposób tłumienia aktywności enzymu przez produkt końcowy łańcucha reakcji ze sprzężeniem zwrotnym. Jak ustalili J. Monod, J. Change, F. Jacob, A. Purdy i inni badacze (1956 - 1960), regulacja aktywności enzymu może być przeprowadzona zgodnie z zasadą allosteryczną. Enzym lub jedna z jego podjednostek, oprócz powinowactwa do substratu, wykazuje powinowactwo do jednego z produktów łańcucha reakcji. Pod wpływem takiego produktu sygnałowego enzym zmienia swoją konformację w taki sposób, że traci aktywność. W efekcie cały łańcuch reakcji enzymatycznych zostaje wyłączony już na samym początku. D. Wieman i R. Woodward (1952; noblista 1965) zwrócili uwagę na istotną rolę zmian konformacyjnych białek w reakcjach enzymatycznych iw pewnym sensie na obecność efektu allosterycznego.

Budowa i funkcja białek

W wyniku prac T. Osborna, G. Hofmeistera, A. Gurbera, F. Schulza i wielu innych pod koniec XIX wieku. Wiele białek zwierzęcych i roślinnych otrzymano w postaci krystalicznej. Mniej więcej w tym samym czasie określono masę cząsteczkową niektórych białek różnymi metodami fizycznymi. Tak więc w 1891 r. A. Sabaneev i N. Alexandrov podali, że masa cząsteczkowa albuminy jaja kurzego wynosi 14 000; w 1905 r. E. Reid odkrył, że masa cząsteczkowa hemoglobiny wynosi 48 000. Polimerową strukturę białek odkryli w 1871 r. G. Glasivetz i D. Gaberman. Ideę wiązania peptydowego poszczególnych reszt aminokwasowych w białkach przedstawił T. Curtius (1883). Prace nad chemiczną kondensacją aminokwasów (E. Schaal, 1871; G. Schiff, 1897; L. Balbiano i D. Traschiatti, 1900) i syntezą heteropolipeptydów (E. Fisher, 1902 - 1907, Nagroda Nobla, 1902) doprowadziło do opracowania podstawowych zasad budowy chemicznej białek.

Pierwszy enzym krystaliczny (ureazę) otrzymał w 1926 r. J. Sumner (Nagroda Nobla, 1946), aw 1930 r. J. Northrop (Nagroda Nobla, 1946) otrzymał krystaliczną pepsynę. Po tych pracach stało się jasne, że enzymy mają charakter białkowy. W 1940 roku M. Kunits wyizolował krystaliczną RNazę. Do 1958 roku znanych było już ponad 100 enzymów krystalicznych i ponad 500 enzymów niekrystalicznych. Uzyskanie wysoko oczyszczonych preparatów poszczególnych białek przyczyniło się do rozszyfrowania ich struktury pierwszorzędowej i organizacji makrocząsteczkowej.

Ogromne znaczenie dla rozwoju biologii molekularnej w ogóle, aw szczególności genetyki człowieka, miało odkrycie przez L. Paulinga (1940) nieprawidłowej hemoglobiny S, wyizolowanej z erytrocytów osób z ciężką chorobą dziedziczną, anemią sierpowatą. W latach 1955 - 1957 W. Ingram wykorzystał metodę „odcisków palców” opracowaną przez F. Sangera (plamki utworzone przez poszczególne peptydy podczas chromatografii na papierze) do analizy produktów hydrolizy hemoglobiny S alkaliami i trypsyną. W 1961 roku Ingram poinformował, że hemoglobina S różni się od normalnej hemoglobiny tylko charakterem jednej reszty aminokwasowej: w normalnej hemoglobinie reszta kwasu glutaminowego znajduje się na siódmej pozycji łańcucha, aw hemoglobinie S reszta waliny. Tak więc założenie Paulinga (1949), że anemia sierpowata jest chorobą o charakterze molekularnym, zostało w pełni potwierdzone. Odziedziczona zmiana tylko jednej reszty aminokwasowej w każdej połowie makrocząsteczki hemoglobiny prowadzi do tego, że hemoglobina traci zdolność łatwego rozpuszczania się przy niskim stężeniu tlenu i zaczyna krystalizować, co prowadzi do rozerwania struktury komórkowej. Badania te wyraźnie pokazały, że struktura białka to ściśle określona sekwencja aminokwasowa zakodowana w genomie. Prace K. Anfinsena (1951) świadczą o wyjątkowym znaczeniu pierwszorzędowej struktury białka w tworzeniu unikalnej biologicznie aktywnej konformacji makrocząsteczki. Anfinsen wykazał, że biologicznie aktywna makrostruktura rybonukleazy trzustkowej, która jest tracona w wyniku odbudowy, jest z góry określona przez sekwencję aminokwasów i może spontanicznie pojawić się ponownie podczas utleniania grup SH reszt cysteiny z tworzeniem wiązań dwusiarczkowych w ściśle określone miejsca łańcucha peptydowego enzymu.

Do tej pory szczegółowo zbadano mechanizm działania dużej liczby enzymów i określono strukturę wielu białek.

W 1953 roku F. Sanger ustalił sekwencję aminokwasową insuliny. : Białko to składa się z dwóch łańcuchów polipeptydowych połączonych dwoma mostkami dwusiarczkowymi. Jeden z łańcuchów zawiera tylko 21 reszt aminokwasowych, podczas gdy drugi zawiera 30 reszt. Sanger spędził około 10 lat na rozszyfrowywaniu struktury tego stosunkowo prostego białka. Za te wybitne badania otrzymał w 1958 roku Nagrodę Nobla. Po stworzeniu przez V. Steina i S. Moore'a (1957) automatycznego analizatora aminokwasów identyfikacja produktów częściowej hydrolizy białek znacznie przyspieszyła. Już w 1960 roku Stein i Moore o tym poinformowali. że byli w stanie określić sekwencję rybonukleazy, której łańcuch peptydowy jest reprezentowany przez 124 reszty aminokwasowe. W tym samym roku w laboratorium G. Schramma w Tybindze (Niemcy) F. Anderer i inni ustalili sekwencję aminokwasową w białku TMV. Następnie określono sekwencję aminokwasów w mioglobinie (A. Edmunson) oraz łańcuchach α i β ludzkiej hemoglobiny (G. Braunitzer, E. Schroeder i in.), lizozymie z białka jaja (J. Jollet, D. Keyfield) . W 1963 roku F. Shorm i B. Keil (Czechosłowacja) ustalili sekwencję aminokwasów w cząsteczce chymotrypsynogenu. W tym samym roku określono sekwencję aminokwasową trypsynogenu (F. Shorm, D. Walsh). W 1965 roku K. Takahashi ustalił pierwotną strukturę rybonukleazy T1. Następnie określono sekwencję aminokwasową dla kilku kolejnych białek.

Jak wiadomo, ostatecznym dowodem poprawności definicji określonej struktury jest jej synteza. W 1969 r. R. Merifield (USA) jako pierwszy przeprowadził chemiczną syntezę rybonukleazy trzustkowej. Wykorzystując metodę syntezy, którą opracował na nośniku w fazie stałej, Merifield dodał jeden aminokwas po drugim do łańcucha zgodnie z sekwencją opisaną przez Steina i Moore'a. W rezultacie otrzymał białko o właściwościach identycznych z rybonukleazą trzustkową A. Za odkrycie struktury rybonukleazy V. Stein, S. Moore i K. Anfinsen otrzymali Nagrodę Nobla w 1972 roku. Ta naturalna synteza białek otwiera ogromne perspektywy, wskazując na możliwość tworzenia dowolnych białek zgodnie z wcześniej zaplanowaną sekwencją.

Z badań rentgenowskich W. Astbury'ego (1933) wynikało, że łańcuchy peptydowe cząsteczek białka są skręcone lub ułożone w stos w jakiś ściśle określony sposób. Od tego czasu wielu autorów sformułowało różne hipotezy dotyczące sposobów fałdowania łańcuchów białkowych, ale do 1951 roku wszystkie modele pozostawały konstrukcjami spekulatywnymi, które nie odpowiadały danym eksperymentalnym. W 1951 roku L. Pauling i R. Corey opublikowali serię błyskotliwych prac, w których ostatecznie sformułowano teorię drugorzędowej struktury białek, teorię α-helisy. Wraz z tym okazało się również, że białka mają również trzeciorzędową strukturę: α-helisa łańcucha peptydowego może być zwinięta w określony sposób, tworząc raczej zwartą strukturę.

W 1957 roku J. Kendrew i jego współpracownicy po raz pierwszy zaproponowali trójwymiarowy model struktury mioglobiny. Model ten był następnie udoskonalany przez kilka lat, aż w 1961 roku pojawiła się ostateczna praca z charakterystyką struktury przestrzennej tego białka. W 1959 r. M. Perutz i współpracownicy ustalili trójwymiarową strukturę hemoglobiny. Naukowcy poświęcili tej pracy ponad 20 lat (pierwsze zdjęcia rentgenowskie hemoglobiny uzyskał Perutz w 1937 r.). Ponieważ cząsteczka hemoglobiny składa się z czterech podjednostek, po rozszyfrowaniu jej organizacji, Perutz jako pierwszy opisał czwartorzędową strukturę białka. Za pracę nad określeniem trójwymiarowej struktury białek Kendrew i Perutz otrzymali w 1962 roku Nagrodę Nobla.

Stworzenie przestrzennego modelu struktury hemoglobiny przez Perutza DOZWOLONE. zbliżyć się do zrozumienia mechanizmu działania tego białka, które jak wiadomo odpowiada za transport tlenu w komórkach zwierzęcych. Już w 1937 roku F. Gaurowitz doszedł do wniosku, że interakcji hemoglobiny z tlenem, powietrzem powinna towarzyszyć zmiana struktury białka. W latach sześćdziesiątych Perutz i współpracownicy odkryli zauważalne przesunięcie w łańcuchach hemoglobiny po jej utlenieniu, spowodowane przesunięciem atomów żelaza w wyniku wiązania z tlenem. Na tej podstawie powstały idee dotyczące „oddychania” makrocząsteczek białkowych.

W 1960 roku D. Phillips i jego współpracownicy rozpoczęli badania dyfrakcji rentgenowskiej cząsteczki lizozymu. Do 1967 roku byli mniej więcej w stanie ustalić szczegóły organizacji tego białka i lokalizację poszczególnych atomów w jego cząsteczce. Ponadto Phillips odkrył naturę dodatku lizozymu do substratu (triacetyloglukozaminy). Umożliwiło to odtworzenie mechanizmu działania tego enzymu. Znajomość struktury pierwszorzędowej i organizacji makrocząsteczek pozwoliła więc nie tylko ustalić naturę centrów aktywnych wielu enzymów, ale także w pełni ujawnić mechanizm działania tych makrocząsteczek.

Zastosowanie metod mikroskopii elektronowej pomogło ujawnić zasady organizacji makrocząsteczkowej tak złożonych formacji białkowych, jak kolagen, fibrynogen, kurczliwe włókienka mięśniowe itp. Pod koniec lat pięćdziesiątych XX wieku zaproponowano modele aparatu kurczliwego mięśni. Wyjątkowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmu skurczu mięśni miało odkrycie przez V. A. Engelgardta i M. N. Lyubimova (1939) aktywności ATPazy miozyny. Oznaczało to, że czynność skurczu mięśnia polega na zmianie właściwości fizykochemicznych i organizacji makrocząsteczkowej białka kurczliwego pod wpływem kwasu adenozynotrójfosforowego (patrz także rozdział 11).

Badania wirusologiczne były niezbędne do zrozumienia zasad składania struktur biologicznych (patrz rozdział 25).

Nie rozwiązane problemy

Główne postępy we współczesnej biologii molekularnej zostały osiągnięte głównie w wyniku badania kwasów nukleinowych. Jednak nawet w tej dziedzinie nie wszystkie problemy zostały rozwiązane. Odszyfrowanie całej sekwencji nukleotydowej genomu będzie wymagało w szczególności wielkich wysiłków. Problem ten z kolei nierozerwalnie łączy się z problemem heterogeniczności DNA i wymaga opracowania nowych zaawansowanych metod frakcjonowania i izolacji poszczególnych cząsteczek z całości materiału genetycznego komórki.

Do tej pory wysiłki koncentrowały się głównie na oddzielnych badaniach białek i kwasów nukleinowych. W komórce biopolimery te są ze sobą nierozerwalnie połączone i funkcjonują głównie w postaci nukleoprotein. Dlatego potrzeba zbadania interakcji białek i kwasów nukleinowych stała się obecnie szczególnie dotkliwa. Na pierwszy plan wysunięto problem rozpoznawania przez białka pewnych odcinków kwasów nukleinowych. Nakreślono już kroki w kierunku zbadania takiej interakcji tych biopolimerów, bez której pełne zrozumienie struktury i funkcji chromosomów, rybosomów i innych struktur jest nie do pomyślenia. Bez tego nie da się też zrozumieć regulacji aktywności genów i ostatecznie rozszyfrować zasady działania mechanizmów syntezy białek. Po pracach Jacoba i Monoda pojawiły się nowe dane dotyczące regulacyjnego znaczenia membran w syntezie materiału jądrowego. Stawia to problem głębszego zbadania roli błon w regulacji replikacji DNA. Ogólnie rzecz biorąc, problem regulacji aktywności genów i ogólnie aktywności komórek stał się jednym z najważniejszych problemów współczesnej biologii molekularnej.

Aktualny stan biofizyki

W ścisłym związku z problematyką biologii molekularnej postępował rozwój biofizyki. Zainteresowanie tą dziedziną biologii było stymulowane z jednej strony potrzebą kompleksowego badania wpływu różnych rodzajów promieniowania na organizm, z drugiej zaś potrzebą zbadania fizycznych i fizykochemiczne podstawy zjawisk życiowych zachodzących na poziomie molekularnym.

Uzyskanie dokładnych informacji o strukturach molekularnych i zachodzących w nich procesach stało się możliwe dzięki zastosowaniu nowych precyzyjnych metod fizycznych i chemicznych. W oparciu o osiągnięcia elektrochemii udało się udoskonalić metodę pomiaru potencjałów bioelektrycznych za pomocą elektrod jonoselektywnych (G. Eisenman, B.P. Nikolsky, Khuri, 50-60s). Coraz częściej do praktyki wchodzi spektroskopia w podczerwieni (z wykorzystaniem urządzeń laserowych), która umożliwia badanie zmian konformacyjnych białek (I. Plotnikov, 1940). Cennych informacji dostarcza również metoda elektronowego rezonansu paramagnetycznego (E. K. Zavoisky, 1944) oraz metoda biochemiluminescencyjna (B. N. Tarusov i in., 1960), które umożliwiają w szczególności ocenę transportu elektronów podczas procesów utleniania.

W latach pięćdziesiątych biofizyka zdobywała już silną pozycję. Istnieje potrzeba szkolenia wykwalifikowanych specjalistów. Jeśli w 1911 roku w Europie tylko Uniwersytet w Peczu na Węgrzech miał katedrę biofizyki, to do 1973 roku takie katedry istnieją na prawie wszystkich większych uniwersytetach.

W 1960 roku zorganizowano Międzynarodowe Towarzystwo Biofizyków. W sierpniu 1961 roku w Sztokholmie odbył się pierwszy Międzynarodowy Kongres Biofizyczny. Drugi kongres odbył się w 1965 roku w Paryżu, trzeci w 1969 roku w Bostonie, czwarty w 1972 roku w Moskwie.

W biofizyce istnieje wyraźne rozróżnienie między dwoma obszarami o różnej treści – biofizyką molekularną i biofizyką komórkową. Wyróżnienie to otrzymuje także wyraz organizacyjny: powstają odrębne katedry tych dwóch dziedzin biofizyki. Na Uniwersytecie Moskiewskim pierwszy wydział biofizyki powstał w 1953 roku na Wydziale Biologii i Gleboznawstwa, a nieco później na Wydziale Fizyki pojawił się Zakład Biofizyki. Na tej samej zasadzie zorganizowano katedry w wielu innych uczelniach.

Biofizyka molekularna

W ostatnich latach związek między biofizyką molekularną a biologią molekularną jest coraz bardziej zacieśniany i obecnie czasami trudno jest określić, gdzie przebiega linia podziału między nimi. W ogólnym ataku na problem informacji dziedzicznej taka współpraca między biofizyką a biologią molekularną jest nieunikniona.

Głównym kierunkiem prac badawczych jest badanie fizyki kwasów nukleinowych - DNA i RNA. Zastosowanie powyższych metod, a przede wszystkim analizy dyfrakcji rentgenowskiej, przyczyniło się do rozszyfrowania struktury molekularnej kwasów nukleinowych. Obecnie trwają intensywne badania nad zachowaniem się tych kwasów w roztworach. Szczególną uwagę zwrócono na przejścia konformacyjne „helisa-cewka”, które są badane poprzez zmiany lepkości, parametrów optycznych i elektrycznych. W związku z badaniem mechanizmów mutagenezy prowadzone są badania mające na celu zbadanie wpływu promieniowania jonizującego na zachowanie kwasów nukleinowych w roztworach, a także wpływu promieniowania na kwasy nukleinowe wirusów i fagów. Kompleksowej analizie poddano wpływ promieniowania ultrafioletowego, którego niektóre obszary widmowe są dobrze absorbowane przez kwasy nukleinowe. Duży udział w tego rodzaju badaniach ma wykrywanie aktywnych rodników kwasów nukleinowych i białek metodą elektronowego rezonansu paramagnetycznego. Zastosowanie tej metody wiąże się z pojawieniem się całego niezależnego kierunku.

Problem kodowania informacji DNA i RNA oraz jej przekazywania podczas syntezy białek od dawna interesuje biofizykę molekularną, a fizycy wielokrotnie wyrażali pewne rozważania na ten temat (E. Schrödinger, G. Gamow). Rozszyfrowanie kodu genetycznego zaowocowało licznymi badaniami teoretycznymi i eksperymentalnymi nad budową helisy DNA, mechanizmem przesuwania i skręcania się jej nici oraz badaniem sił fizycznych zaangażowanych w te procesy.

Biofizyka molekularna stanowi znaczną pomoc dla biologii molekularnej w badaniu struktury cząsteczek białek za pomocą analizy dyfrakcji rentgenowskiej, którą po raz pierwszy zastosował w 1930 r. J. Bernal. To właśnie w wyniku zastosowania metod fizycznych w połączeniu z metodami biochemicznymi (metodami enzymatycznymi) ujawniono konformację molekularną i sekwencję aminokwasów w wielu białkach.

Współczesne badania mikroskopii elektronowej, które ujawniły obecność złożonych systemów błon w komórce i jej organellach, stały się bodźcem do prób zrozumienia ich struktury molekularnej (patrz rozdziały 10 i 11). Skład chemiczny błon, aw szczególności właściwości ich lipidów są badane in vivo. Stwierdzono, że te ostatnie są zdolne do przetlenienia i nieenzymatycznych reakcji utleniania łańcucha (Yu. A. Vladimirov i F. F. Litvin, 1959; B. N. Tarusov i in., 1960; I. I. Ivanov, 1967), prowadzących do dysfunkcji błony. Do badania składu membran zaczęto również stosować metody modelowania matematycznego (V. Ts. Presman, 1964 - 1968; M. M. Shemyakin, 1967; Yu. A. Ovchinnikov, 1972).

Biofizyka komórkowa

Znaczącym wydarzeniem w historii biofizyki było ukształtowanie się w latach 50-tych jasnych idei dotyczących termodynamiki procesów biologicznych, w wyniku których założenia o możliwości samodzielnego wytwarzania energii w żywych komórkach, sprzeczne z drugą zasadą termodynamiki, w końcu zniknął. Zrozumienie działania tego prawa w układach biologicznych wiąże się z wprowadzeniem przez belgijskiego naukowca I. Prigogine (1945)* do termodynamiki biologicznej koncepcji układów otwartych wymieniających energię i materię ze środowiskiem zewnętrznym. Prigogine wykazał, że dodatnia entropia powstaje w żywych komórkach podczas procesów roboczych zgodnie z drugą zasadą termodynamiki. Wprowadzone przez niego równania określały warunki, w jakich powstaje tzw. stan stacjonarny (wcześniej nazywany był również równowagą dynamiczną), w którym ilość energii swobodnej (negentropii) wchodzącej do komórek wraz z pokarmem kompensuje jego zużycie, a dodatnia entropia wynosi wyjście. To odkrycie wzmocniło ogólną biologiczną ideę nierozerwalnego związku między zewnętrznym i wewnętrznym środowiskiem komórek. To zapoczątkowało prawdziwe badanie termodynamiki systemów żywych, w tym metody modelowania (A. Burton, 1939; A. G. Pasynsky, 1967).

* (Ogólna teoria systemów otwartych została po raz pierwszy przedstawiona przez L. Bertalanffy'ego w 1932 roku.)

Zgodnie z podstawową zasadą biotermodynamiki warunkiem koniecznym istnienia życia jest stacjonarność w rozwoju jego procesów biochemicznych, dla realizacji których konieczna jest koordynacja tempa wielu reakcji metabolicznych. Na gruncie nowej termodynamiki biofizycznej wyłonił się nurt wyróżniający zewnętrzne i wewnętrzne czynniki, które zapewniają tę koordynację reakcji i czynią ją stabilną. W ciągu ostatnich dwóch dekad ujawniono dużą rolę w utrzymaniu stanu stacjonarnego układu inhibitorów, a zwłaszcza przeciwutleniaczy (B. N. Tarusov i A. I. Zhuravlev, 1954, 1958). Ustalono, że niezawodność rozwoju stacjonarnego jest związana z czynnikami środowiskowymi (temperatura) oraz właściwościami fizykochemicznymi środowiska komórki.

Współczesne zasady biotermodynamiki umożliwiły fizykochemiczną interpretację mechanizmu adaptacji. Według naszych danych adaptacja do warunków środowiskowych może nastąpić tylko wtedy, gdy przy ich zmianie organizm jest w stanie ustalić stacjonarność w rozwoju reakcji biochemicznych (B.N. Tarusov, 1974). Pojawiło się pytanie o opracowanie nowych metod, które pozwoliłyby na ocenę stanu stacjonarnego in vivo i przewidywanie jego ewentualnych naruszeń. Wprowadzenie cybernetycznych zasad samoregulujących się systemów do biotermodynamiki i badania nad procesami biologicznej adaptacji obiecuje wielkie korzyści. Stało się jasne, że dla rozwiązania problemu stabilności stanu ustalonego istotne jest uwzględnienie tzw. czynników zakłócających, do których należą w szczególności nieenzymatyczne reakcje utleniania lipidów. W ostatnim czasie rozwijają się badania procesów peroksydacji w fazach lipidowych żywych komórek oraz wzrostu produktów aktywnych rodników, które zaburzają funkcje regulacyjne błon. Źródłem informacji o tych procesach jest zarówno wykrywanie aktywnych rodników nadtlenkowych, jak i związków nadtlenkowych biolipidów (A. Tappel, 1965; I. I. Ivanov, 1965; E. B. Burlakova, 1967 i in.). Do wykrywania rodników wykorzystuje się biochemiluminescencję, która zachodzi w lipidach żywych komórek podczas ich rekombinacji.

Na podstawie fizykochemicznych pomysłów na temat stabilności stanu ustalonego powstały biofizyczne idee dotyczące adaptacji roślin do zmian warunków środowiskowych jako naruszenia hamujących układów przeciwutleniających (B. N. Tarusov, Ya. E. Doskoch, B. M. Kitlaev, A. M. Agaverdiev , 1968 - 1972). Otworzyło to możliwość oceny takich właściwości, jak mrozoodporność i tolerancja na sól, a także poczynienia odpowiednich predykcji w doborze roślin rolniczych.

W latach pięćdziesiątych XX wieku odkryto ultrasłabą poświatę - biochemiczną luminescencję wielu obiektów biologicznych w widzialnej i podczerwonej części widma (B. N. Tarusov, A. I. Zhuravlev, A. I. Polivoda). Stało się to możliwe dzięki opracowaniu metod rejestracji supersłabych strumieni światła za pomocą fotopowielaczy (L. A. Kubetsky, 1934). Będąc wynikiem reakcji biochemicznych zachodzących w żywej komórce, biochemiluminescencja umożliwia ocenę ważnych procesów oksydacyjnych w łańcuchach przenoszenia elektronów między enzymami. Odkrycie i badanie biochemiluminescencji ma ogromne znaczenie teoretyczne i praktyczne. Tak więc B. N. Tarusov i Yu. B. Kudryashov zwracają uwagę na wielką rolę produktów utleniania nienasyconych kwasów tłuszczowych w mechanizmie występowania stanów patologicznych, które rozwijają się pod wpływem promieniowania jonizującego, w rakotwórczości i innych naruszeniach normalnych funkcji komórek .

W latach pięćdziesiątych XX wieku, w związku z gwałtownym rozwojem fizyki jądrowej, z biofizyki wyłoniła się radiobiologia, zajmująca się badaniem biologicznych skutków promieniowania jonizującego. Produkcja sztucznych izotopów promieniotwórczych, tworzenie broni termojądrowej, reaktorów atomowych oraz rozwój innych form praktycznego wykorzystania energii atomowej postawiły z całą ostrością problem ochrony organizmów przed szkodliwym działaniem promieniowania jonizującego oraz rozwój teoretyczne podstawy profilaktyki i leczenia choroby popromiennej. Aby to zrobić, trzeba było przede wszystkim dowiedzieć się, które składniki komórki i ogniwa metabolizmu są najbardziej narażone.

Przedmiotem badań biofizyki i radiobiologii było wyjaśnienie natury podstawowych reakcji chemicznych zachodzących w żywych podłożach pod wpływem energii promieniowania. Tutaj ważne było nie tylko zrozumienie mechanizmów tego zjawiska, ale także umiejętność wpływania na proces wymiany energii fizycznej na energię chemiczną, aby zmniejszyć jej współczynnik „użytecznego” działania. Prace w tym kierunku zapoczątkowały studia szkoły N. N. Semenova (1933) w ZSRR i D. Hinshelwooda (1935) w Anglii.

Ważne miejsce w badaniach radiobiologicznych zajmowało badanie stopnia odporności na promieniowanie różnych organizmów. Stwierdzono, że zwiększona oporność na promieniowanie (np. u gryzoni pustynnych) wynika z wysokiej aktywności przeciwutleniającej lipidów błony komórkowej (M. Chang i in., 1964; N. K. Ogryzov i in., 1969). Okazało się, że tokoferole, witamina K i związki tio odgrywają ważną rolę w kształtowaniu właściwości przeciwutleniających tych układów (II Ivanov i in., 1972). W ostatnich latach dużym zainteresowaniem cieszą się również badania mechanizmów mutagenezy. W tym celu bada się wpływ promieniowania jonizującego na zachowanie kwasów nukleinowych i białek in vitro, a także w wirusach i fagach (A. Gustafson, 1945 - 1950).

Walka o dalszy wzrost skuteczności ochrony chemicznej, poszukiwanie skuteczniejszych inhibitorów i zasad inhibicji pozostają głównymi zadaniami biofizyki w tym kierunku.

Poczyniono postępy w badaniu stanów wzbudzonych biopolimerów, które warunkują ich wysoką aktywność chemiczną. Najbardziej udane było badanie stanów wzbudzonych powstających na pierwotnym etapie procesów fotobiologicznych - fotosyntezy i widzenia.

W ten sposób wniesiono solidny wkład w zrozumienie pierwotnej aktywacji cząsteczek systemów barwników roślinnych. Ustalono ogromne znaczenie przenoszenia (migracji) energii stanów wzbudzonych bez strat z aktywowanych pigmentów na inne podłoża. Dużą rolę w rozwoju tych idei odegrały prace teoretyczne A. N. Terenina (1947 i później). A. A. Krasnovsky (1949) odkrył i zbadał reakcję odwracalnej fotochemicznej redukcji chlorofilu i jego analogów. Obecnie panuje powszechne przekonanie, że w niedalekiej przyszłości możliwe będzie odtworzenie fotosyntezy w sztucznych warunkach (patrz także rozdział 5).

Biofizycy nadal pracują nad odkryciem natury skurczu mięśni oraz mechanizmów pobudzenia i przewodzenia nerwów (patrz rozdział 11). Współczesnego znaczenia nabrały również badania nad mechanizmami przejścia ze stanu wzbudzonego do stanu normalnego. Stan wzbudzony jest obecnie uważany za wynik reakcji autokatalitycznej, a inhibicja jest uważana za konsekwencję gwałtownej mobilizacji hamującej aktywności przeciwutleniającej w wyniku przegrupowań molekularnych w związkach takich jak tokoferol (I.I. Ivanov, O.R. Kols, 1966; O.R. Kols, 1970).

Najważniejszym ogólnym problemem biofizyki pozostaje znajomość jakościowych cech fizycznych i chemicznych żywej materii. Właściwości takie jak zdolność żywych biopolimerów do selektywnego wiązania potasu czy polaryzacji prądu elektrycznego nie mogą zostać zachowane nawet przy najostrożniejszym usunięciu z organizmu. Dlatego biofizyka komórki nadal intensywnie rozwija kryteria i metody badania życia żywej materii.

Pomimo młodości biologii molekularnej postęp, jaki dokonała się w tej dziedzinie, jest naprawdę oszałamiający. W stosunkowo krótkim czasie ustalono naturę genu oraz podstawowe zasady jego organizacji, reprodukcji i funkcjonowania. Ponadto przeprowadzono nie tylko reprodukcję genów in vitro, ale także po raz pierwszy dokonano pełnej syntezy samego genu. Kod genetyczny został całkowicie rozszyfrowany i rozwiązany został najważniejszy biologiczny problem specyfiki biosyntezy białek. Zidentyfikowano i zbadano główne sposoby i mechanizmy powstawania białek w komórce. Pierwotna struktura wielu transportowych RNA, swoistych cząsteczek adaptorowych, które tłumaczą język matryc nukleinowych na język sekwencji aminokwasowej syntetyzowanego białka, została całkowicie określona. Sekwencja aminokwasowa wielu białek została w pełni rozszyfrowana, a struktura przestrzenna niektórych z nich została ustalona. Umożliwiło to wyjaśnienie zasady i szczegółów funkcjonowania cząsteczek enzymów. Przeprowadzono syntezę chemiczną jednego z enzymów, rybonukleazy. Ustalono podstawowe zasady organizacji różnych cząstek subkomórkowych, wielu wirusów i fagów oraz odkryto główne sposoby ich biogenezy w komórce. Odkryto podejścia do zrozumienia sposobów regulacji aktywności genów i wyjaśnienia mechanizmów regulujących aktywność życiową. Już prosta lista tych odkryć wskazuje, że w drugiej połowie XX wieku. odznaczał się ogromnym postępem w biologii, który zawdzięczamy przede wszystkim dogłębnym badaniom struktury i funkcji biologicznie ważnych makrocząsteczek – kwasów nukleinowych i białek.

Osiągnięcia biologii molekularnej są już dziś wykorzystywane w praktyce i przynoszą wymierne efekty w medycynie, rolnictwie i niektórych gałęziach przemysłu. Nie ma wątpliwości, że powrót tej nauki będzie wzrastał każdego dnia. Jednak za główny wniosek nadal należy uznać to, że pod wpływem sukcesów biologii molekularnej umocniła się wiara w istnienie nieograniczonych możliwości na drodze do ujawnienia najskrytszych tajemnic życia.

Najwyraźniej w przyszłości zostaną otwarte nowe sposoby badania biologicznej formy ruchu materii - biologia przejdzie z poziomu molekularnego na poziom atomowy. Jednak obecnie nie ma chyba ani jednego badacza, który mógłby realistycznie przewidzieć rozwój biologii molekularnej nawet na najbliższe 20 lat.

Na now.nsexy.ru/ spędzisz niezapomniany czas.

BIOLOGIA MOLEKULARNA BIOLOGIA MOLEKULARNA

studiowanie podstaw właściwości i przejawy życia na poziomie molekularnym. Najważniejsze kierunki w M. b. to badania strukturalnej i funkcjonalnej organizacji aparatu genetycznego komórek oraz mechanizmu wdrażania informacji dziedzicznej (genetyka molekularna), badanie molo. mechanizmy interakcji wirusów z komórkami (wirusologia molekularna), badanie wzorców reakcji immunologicznych organizmu (immunologia molekularna), badanie pojawiania się różnej jakości komórek w przebiegu indywidualnego rozwoju organizmów oraz specjalizacja komórek (rozwój M. b.) itp. M. b. wyłoniła się z biochemii i wyłoniła się jako niezależna nauka w latach pięćdziesiątych XX wieku. urodzenia M.. często przypisywany 1953 r., kiedy opublikowano pracę J. Watsona i F. Cricka na temat przestrzennej struktury cząsteczki DNA (tzw. podwójnej helisy) oraz biol. funkcja tej cząsteczki była związana z jej substancją chemiczną. struktura (już w 1944 roku O. Avery i in. ustalili, że DNA jest nośnikiem dziedziczenia, informacji). W formacji M. dużą rolę odegrały idee i metody genetyki klasycznej, mikrobiologii, wirusologii, wykorzystanie dorobku nauk ścisłych – fizyki, chemii, matematyki, krystalografii, zwłaszcza rentgenowskiej analizy dyfrakcyjnej). Główny obiekty badań w M.. to wirusy, w tym bakteriofagi, komórki i struktury subkomórkowe (jądra, mitochondria, rybosomy, chromosomy, błony komórkowe), a także makrocząsteczki (białka, kwasy nukleinowe). Naib, główne osiągnięcia M. - rozszyfrowanie struktury białek nek-ry i ustalenie związku między ich budową a funkcją (M. Peruts, J. Kendrew, F. Sanger, K. Anfinsen i in.), określenie struktury i mechanizm biol. funkcje nukleinowego to -t i rybosomów (J. Watson, F. Crick, R. Holley i in.), dekodowanie genetyczne. kod (M. Nirenberg, S. Ochoa), odkrycie odwrotnej transkrypcji (X. Temin, D. Baltimore), mechanizm działania głównego. etapy biosyntezy cząsteczki białka (F. Crick, F. Jacob, J. Mono) i kwasów nukleinowych (A. Kornberg, S. Ochoa), ustalanie struktury wirusów i mechanizmów ich replikacji, rozwój metod inżynierii genetycznej (P. Berg, V Arber, G. O. Smith, D. Nathan), syntezy genów (X. Koran) itp. Sov. naukowcy są właścicielami sformułowania zasady matrycowej syntezy biopolimerów (N. K. Koltsov), powstania podstaw nowoczesności. bioenergetyka i mechapochemia (V. A. Engelgardt), dowód na istnienie DNA w roślinach wyższych (N. A. Belozersky), tworzenie wirogenetyki. teoria początku raka (L. A. Zilber), ustalenie sekwencji nukleotydów w transferze RNA (A. A. Baev), odkrycie i badanie informosomów (A. S. Spirin) itp. M. b. ma ogromne znaczenie praktyczne w rozwoju x-va (ukierunkowane i kontrolowane zmiany w aparacie dziedzicznym zwierząt i roślin w celu uzyskania wysoce produktywnych ras i odmian), przemysł mikrobiologiczny (synteza bakteryjna biologicznie aktywnych polipeptydów i białek, aminokwasów itp.) oraz jako teoretyczny. podstawa dec. sekcje medycyny (wirusologia, immunologia itp.). przed M.b. mówią, że zadaniem jest rozwiązywanie problemów. podstawy rozwoju nowotworów złośliwych, zapobieganie chorobom dziedzicznym, wyjaśnienie molekularnych podstaw katalizy, działanie hormonów, toksyczne. i substancji leczniczych, znajomość mechanizmów pamięci, natury procesów nerwowych. Ogromne znaczenie ma rozwój inżynierii genetycznej, która umożliwia celowe operowanie genetyką. aparat organizmów zwierzęcych. M.b. wraz z biochemią, biofizyką, chemią bioorganiczną są często łączone w jeden ogólny kierunek - biologię fizyczną i chemiczną.

.(Źródło: „Biological Encyclopedic Dictionary”. Redaktor naczelny M. S. Gilyarov; Redakcja: A. A. Babaev, G. G. Vinberg, G. A. Zavarzin i inni - wyd. 2, poprawione. - M .: Sov. Encyclopedia, 1986.)

Gałąź biologii, która bada struktury i procesy właściwe żywym organizmom na poziomie molekularnym. Biologia molekularna stara się wyjaśnić najważniejsze zjawiska życia (dziedziczność, zmienność, wzrost, rozwój, ruch, metabolizm i energię, wrażliwość, odporność itp.) poprzez strukturę, właściwości i interakcje substancji chemicznych tworzących organizmy. W każdym organizmie, w każdym momencie jego istnienia, zachodzi ogromna liczba reakcji biochemicznych, w których uczestniczą cząsteczki duże i małe, proste i złożone, organiczne i nieorganiczne. Wszystkie te reakcje są ściśle uporządkowane iw zależności od warunków i potrzeb organizmu podlegają dostrajaniu i regulacji. Decydującą rolę w organizacji tych procesów odgrywają dwie klasy dużych cząsteczek - białka oraz kwasy nukleinowe. Te biopolimery służą jako główny przedmiot badań w biologii molekularnej.
Biologia molekularna od samego początku rozwijała się jako dziedzina naukowa związana przede wszystkim z biochemią i biofizyką, a także genetyką, mikrobiologią i wirusologią. W latach 30-40. XX wiek do ustalenia struktury przestrzennej najważniejszych białek zaczęto stosować analizę dyfrakcji rentgenowskiej, która następnie odegrała decydującą rolę w ustaleniu struktury DNA. Wprowadzenie metod i idei fizyki i chemii do biologii w tych latach położyło podwaliny pod rozwój kierunku „molekularnego”. Pod wieloma względami jego przyszłe sukcesy z góry zdeterminowały zainteresowanie fizyków i chemików tym problemem dziedziczność. W 1944 roku ukazała się książka jednego z twórców mechaniki kwantowej, E. Schrödingera, „Czym jest życie? Z punktu widzenia fizyka”, która zawierała podsumowanie podstaw genetyki. Praca ta została odebrana przez wielu przedstawicieli nauk ścisłych jako wezwanie do skoncentrowania wysiłków na rozwiązaniu zagadki „substancji dziedziczności”.
Po 9 latach J. Watson i F. Crick rozwiązali ten problem. Do czasu opublikowania ich artykułu (kwiecień 1953), w którym zaproponowano model cząsteczki DNA (tzw. podwójnej helisy), zwyczajowo przypisuje się narodziny biologii molekularnej. Model Watsona-Cricka żywo wyrażał główny kierunek nowej nauki: biologiczne funkcje makrocząsteczki można wytłumaczyć jej strukturą (por. Kwasy dezoksyrybonukleinowe). Jednocześnie poziom molekularny (dwuniciowy DNA) został logicznie powiązany z poziomem subkomórkowym (replikacja chromosomy), komórkowy ( mitoza, mejoza) i organizmiczne (dziedziczenie cech).
Z podobnym podejściem spotykano się również we wcześniejszych pracach. W 1927 roku N.K. Kolcow wyraził hipotezę o „dziedzicznych cząsteczkach” zdolnych do reprodukcji przez syntezę macierzy, a V.A. Engelhardtowi w 1939 roku udało się powiązać strukturę białek mięśniowych z ich rolą w skurczu mięśni. Jednak dopiero po „podwójnej helisie” rozpoczął się szybki rozwój biologii molekularnej, która stała się liderem nauk przyrodniczych. Oprócz licznych konkretnych osiągnięć (rozszyfrowanie kod genetyczny, ujawnienie mechanizmów biosyntezy białek, struktury przestrzennej enzymów i innych białek, struktury i roli błon biologicznych w procesach komórkowych itp.), biologia molekularna ujawniła pewne ogólne zasady, na podstawie których przeprowadzane są procesy. Tak więc komplementarność oddziałujących cząsteczek (ich komplementarność, wzajemna korespondencja jako „klucz i zamek”), prowadząca do powstania między nimi niekowalencyjnych wiązań chemicznych, leży u podstaw procesów wymagających biologicznej specyficzności (selektywności, „rozpoznania”), począwszy od od syntezy DNA i białek, a skończywszy na tworzeniu kompleksów między enzymem a substratem, przeciwciałem i antygenem, samoorganizacji cząstek wirusowych i cytoszkieletu. Podobnie zasada syntezy macierzy jest wykorzystywana przez komórki nie jednorazowo, ale na różnych etapach wdrażania informacji genetycznej.
W kwietniu 2003 roku naukowcy na całym świecie świętowali półwiecze istnienia „podwójnej helisy” i biologii molekularnej. W naszym kraju podwaliny pod rozwój tego kierunku położyły prace akademików V.A. Engelhardt (1894-1984), AN Biełozerski (1905-1972), A.A. Baeva (1903/04-1994).

.(Źródło: „Biologia. Nowoczesna ilustrowana encyklopedia”. Redaktor naczelny A.P. Gorkin; M.: Rosmen, 2006.)

Zobacz, czym jest „BIOLOGIA MOLEKULARNA” w innych słownikach:

Bada podstawowe właściwości i przejawy życia na poziomie molekularnym. Dowiaduje się, w jaki sposób i w jakim stopniu wzrost i rozwój organizmów, przechowywanie i przekazywanie informacji dziedzicznej, przemiana energii w żywych komórkach i inne zjawiska są spowodowane ... Wielki słownik encyklopedyczny

Współczesna encyklopedia

BIOLOGIA MOLEKULARNA, biologiczne badanie struktury i funkcji CZĄSTECZEK tworzących żywe organizmy. Główne obszary badań obejmują właściwości fizyczne i chemiczne białek oraz KWASÓW NUKLEINOWYCH, takich jak DNA. Zobacz też… … Naukowy i techniczny słownik encyklopedyczny

Sekcja biologii, która bada podstawowe właściwości i przejawy życia na poziomie molekularnym. Dowiaduje się, w jaki sposób i w jakim stopniu następuje wzrost i rozwój organizmów, przechowywanie i przekazywanie informacji dziedzicznej, przemiana energii w żywych komórkach i ... ... Słownik mikrobiologii

Biologia molekularna- — Tematy biotechnologii EN biologia molekularna … Podręcznik tłumacza technicznego

Biologia molekularna- BIOLOGIA MOLEKULARNA, bada podstawowe właściwości i przejawy życia na poziomie molekularnym. Dowiaduje się, w jaki sposób i w jakim stopniu następuje wzrost i rozwój organizmów, przechowywanie i przekazywanie informacji dziedzicznej, przemiana energii w żywych komórkach i ... ... Ilustrowany słownik encyklopedyczny

Ten termin ma inne znaczenie, patrz Biologia Molekularna (czasopismo). Biologia molekularna to kompleks nauk biologicznych, który bada mechanizmy przechowywania, przekazywania i wdrażania informacji genetycznej, struktury i funkcji ... ... Wikipedia

Nauka, która stawia sobie za zadanie poznanie natury zjawisk życiowych poprzez badanie obiektów i układów biologicznych na poziomie zbliżonym do poziomu molekularnego, aw niektórych przypadkach sięgającym tej granicy. Ostatecznym celem tego jest…… Wielka radziecka encyklopedia

Zajmuje się badaniem zjawisk życia na poziomie makrocząsteczek (tzn. białek arr. i kwasów nukleinowych) w strukturach bezkomórkowych (rybosomy itp.), w wirusach, a także w komórkach. celem M. ustalenie roli i mechanizmu funkcjonowania tych makrocząsteczek na podstawie ... ... Encyklopedia chemiczna

Bada podstawowe właściwości i przejawy życia na poziomie molekularnym. Dowiaduje się, w jaki sposób iw jakim stopniu następuje wzrost i rozwój organizmów, przechowywanie i przekazywanie informacji dziedzicznej, przemiana energii w żywych komórkach i inne zjawiska ... ... słownik encyklopedyczny

Można powiedzieć, że biologia molekularna bada przejawy życia na strukturach lub układach nieożywionych wykazujących elementarne oznaki życiowej aktywności (mogą to być pojedyncze makrocząsteczki biologiczne, ich kompleksy lub organelle), badając, w jaki sposób kluczowe procesy charakteryzujące materię ożywioną są realizowane poprzez procesy chemiczne interakcje i transformacje.

Wydzielenie biologii molekularnej z biochemii jako samodzielnej dziedziny nauki podyktowane jest faktem, że jej głównym zadaniem jest badanie struktury i właściwości biologicznych makrocząsteczek biorących udział w różnych procesach, wyjaśnianie mechanizmów ich interakcji. Biochemia natomiast zajmuje się badaniem rzeczywistych procesów czynności życiowych, wzorców ich przebiegu w żywym organizmie oraz towarzyszących tym procesom przemian cząsteczek. Ostatecznie biologia molekularna próbuje odpowiedzieć na pytanie, dlaczego zachodzi taki lub inny proces, podczas gdy biochemia odpowiada na pytanie, gdzie i jak z punktu widzenia chemii zachodzi dany proces.

Historia

Biologia molekularna jako odrębny dział biochemii zaczęła nabierać kształtu w latach trzydziestych XX wieku. Właśnie wtedy dla głębszego zrozumienia fenomenu życia pojawiła się potrzeba ukierunkowanych badań na poziomie molekularnym procesów przechowywania i przekazywania informacji dziedzicznej w organizmach żywych. Następnie zdefiniowano zadanie biologii molekularnej w badaniu struktury, właściwości i interakcji kwasów nukleinowych i białek. Termin „biologia molekularna” został po raz pierwszy użyty przez angielskiego naukowca Williama Astbury'ego w kontekście badań związanych z wyjaśnieniem związku między budową molekularną a właściwościami fizycznymi i biologicznymi białek włóknistych, takich jak kolagen, fibryna krwi, czy białka kurczliwe mięśni .

We wczesnych latach biologii molekularnej RNA uważano za składnik roślin i grzybów, podczas gdy DNA uważano za typowy składnik komórek zwierzęcych. Pierwszym naukowcem, który udowodnił, że DNA występuje w roślinach, był Andriej Nikołajewicz Biełozerski, który wyizolował DNA grochu w 1935 roku. Odkrycie to potwierdziło fakt, że DNA jest uniwersalnym kwasem nukleinowym obecnym w komórkach roślinnych i zwierzęcych.

Głównym osiągnięciem było ustalenie przez George'a Beadle'a i Edwarda Tatuma bezpośredniego związku przyczynowego między genami a białkami. W swoich eksperymentach odsłonili komórki neurospor ( Neurosporakrassa) Ekspozycja na promieniowanie rentgenowskie, która spowodowała mutacje. Uzyskane wyniki wykazały, że doprowadziło to do zmiany właściwości poszczególnych enzymów.

W 1940 roku Albert Claude wyizolował granulki zawierające cytoplazmatyczny RNA z cytoplazmy komórek zwierzęcych, które były mniejsze od mitochondriów. Nazwał je mikrosomami. Następnie, badając strukturę i właściwości wyizolowanych cząstek, ustalono ich fundamentalną rolę w procesie biosyntezy białek. W 1958 roku na pierwszym sympozjum poświęconym tym cząsteczkom postanowiono nazwać te cząstki rybosomami.

Kolejnym ważnym krokiem w rozwoju biologii molekularnej były opublikowane dane z eksperymentu Oswalda Avery'ego, Colina MacLeoda i MacLeana McCarthy'ego z 1944 roku, który wykazał, że przyczyną transformacji bakteryjnej jest DNA. Był to pierwszy eksperymentalny dowód na rolę DNA w przekazywaniu informacji dziedzicznych, obalający wcześniejszy pomysł o białkowej naturze genów.

We wczesnych latach pięćdziesiątych Frederick Sanger wykazał, że łańcuch białkowy jest unikalną sekwencją reszt aminokwasowych. Pod koniec lat pięćdziesiątych Max Perutz i John Kendrew rozszyfrowali przestrzenną strukturę pierwszych białek. Już w 2000 roku poznano setki tysięcy naturalnych sekwencji aminokwasowych i tysiące struktur przestrzennych białek.

Mniej więcej w tym samym czasie badania Erwina Chargaffa pozwoliły mu sformułować reguły opisujące stosunek zasad azotowych w DNA (reguły mówią, że niezależnie od różnic gatunkowych w DNA, ilość guaniny jest równa ilości cytozyny, a ilość adeniny jest równa ilości temin), co później pomogło dokonać największego przełomu w biologii molekularnej i jednego z największych odkryć w biologii w ogóle.

Wydarzenie to miało miejsce w 1953 roku, kiedy James Watson i Francis Crick, opierając się na pracy Rosalind Franklin i Maurice'a Wilkinsa na Analiza dyfrakcji rentgenowskiej DNA, ustalił dwuniciową strukturę cząsteczki DNA. Odkrycie to umożliwiło odpowiedź na fundamentalne pytanie o zdolność nośnika informacji dziedzicznej do samoreprodukcji oraz zrozumienie mechanizmu przekazywania takiej informacji. Ci sami naukowcy sformułowali zasadę komplementarności zasad azotowych, która ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmu powstawania struktur supramolekularnych. Zasada ta, stosowana obecnie do opisu wszystkich kompleksów molekularnych, umożliwia opisanie i przewidywanie warunków powstawania słabych (niewartościowych) oddziaływań międzycząsteczkowych, które determinują możliwość powstawania drugorzędowych, trzeciorzędowych itp. struktury makrocząsteczek, samoorganizacja supramolekularnych układów biologicznych, które determinują tak szeroką różnorodność struktur molekularnych i ich zestawów funkcjonalnych. Następnie, w 1953 roku, ukazało się czasopismo naukowe Journal of Molecular Biology. Kierował nią John Kendrew, którego obszarem zainteresowań naukowych było badanie struktury białek kulistych (Nagroda Nobla w 1962 r., wspólnie z Maxem Perutzem). Podobne rosyjskojęzyczne czasopismo o nazwie Molecular Biology zostało założone w ZSRR przez VA Engelhardta w 1966 roku.

W 1958 roku Francis Crick sformułował tzw. centralny dogmat biologii molekularnej: idea nieodwracalności przepływu informacji genetycznej z DNA przez RNA do białek według schematu DNA → DNA (replikacja, tworzenie kopii DNA), DNA → RNA (transkrypcja, kopiowanie genów), RNA → białko (translacja, dekodowanie informacji o strukturze białek). Dogmat ten został nieco skorygowany w 1970 roku, biorąc pod uwagę zgromadzoną wiedzę, gdyż zjawisko odwrotnej transkrypcji odkryli niezależnie Howard Temin i David Baltimore: odkryto enzym - odwrotną transkryptazę, która jest odpowiedzialna za realizację odwrotnej transkrypcji - tworzenie dwuniciowego DNA na matrycy jednoniciowego RNA, co występuje w wirusach onkogennych. Należy zauważyć, że ścisła konieczność przepływu informacji genetycznej z kwasów nukleinowych do białek nadal pozostaje podstawą biologii molekularnej.

W 1957 roku Aleksander Siergiejewicz Spirin wraz z Andriejem Nikołajewiczem Belozerskim wykazali, że pomimo znacznych różnic w składzie nukleotydów DNA z różnych organizmów, skład całkowitego RNA jest podobny. Na podstawie tych danych doszli do sensacyjnego wniosku, że całkowity RNA komórki nie może pełnić roli nośnika informacji genetycznej z DNA do białek, gdyż nie odpowiada jej składem. Jednocześnie zauważyli, że istnieje niewielka frakcja RNA, która w pełni odpowiada składem nukleotydowym DNA i która może być prawdziwym nośnikiem informacji genetycznej z DNA do białek. W rezultacie przewidzieli istnienie stosunkowo małych cząsteczek RNA, które są analogiczne w budowie do poszczególnych odcinków DNA i pośredniczą w przekazywaniu informacji genetycznej zawartej w DNA do rybosomu, gdzie z wykorzystaniem tej informacji syntetyzowane są cząsteczki białka. W 1961 r. (S. Brenner, F. Jacob, M. Meselson z jednej strony oraz F. Gros, Francois Jacob i Jacques Monod jako pierwsi potwierdzili eksperymentalnie istnienie takich cząsteczek - informacyjnego (macierzowego) RNA. Jednocześnie opracowali koncepcję i model jednostek funkcjonalnych DNA - operonu, który pozwolił dokładnie wyjaśnić, jak przebiega regulacja ekspresji genów u prokariotów. Badanie mechanizmów biosyntezy białek oraz zasad organizacji strukturalnej i działanie maszyn molekularnych – rybosomów – umożliwiło sformułowanie postulatu opisującego przepływ informacji genetycznej, zwanego centralnym dogmatem biologii molekularnej: DNA – mRNA to białko.

W 1961 roku i przez kilka następnych lat Heinrich Mattei i Marshall Nirenberg, a następnie Har Korana i Robert Holly przeprowadzili kilka prac mających na celu rozszyfrowanie kodu genetycznego, w wyniku których ustalono bezpośredni związek między strukturą DNA a syntetyzowanymi białkami oraz sekwencja nukleotydów, która określa zestaw aminokwasów w białku. Uzyskano również dane dotyczące uniwersalności kodu genetycznego. Odkrycia te zostały uhonorowane Nagrodą Nobla w 1968 roku.

Za rozwój współczesnych pomysłów na temat funkcji RNA, odkrycie niekodującego RNA, dokonane na podstawie wyników pracy Aleksandra Siergiejewicza Spirina wraz z Andriejem Nikołajewiczem Belozerskim w 1958 r., Charlesem Brennerem ze współautorami i Saulem Spiegelmana w 1961 roku był decydujący. Ten typ RNA stanowi większość komórkowego RNA. Rybosomalne RNA są głównie niekodujące.

Sposoby hodowli i hybrydyzacji komórek zwierzęcych znacznie się rozwinęły. W 1963 roku François Jacob i Sydney Brenner sformułowali ideę replikonu, sekwencji naturalnie replikujących się genów, która wyjaśnia ważne aspekty regulacji replikacji genów.

W 1967 roku w laboratorium A. S. Spirina po raz pierwszy wykazano, że kształt zwarto sfałdowanego RNA determinuje morfologię cząsteczki rybosomu.

W 1968 roku dokonano ważnego fundamentalnego odkrycia. Okazaki, po odkryciu fragmentów DNA nici opóźnionej w badaniu procesu replikacji, nazwała fragmenty Okazaki jej imieniem, wyjaśniła mechanizm replikacji DNA.

W 1970 roku Howard Temin i David Baltimore niezależnie dokonali znaczącego odkrycia: odkryto enzym - odwrotną transkryptazę, który jest odpowiedzialny za realizację odwrotnej transkrypcji - tworzenie dwuniciowego DNA na matrycy jednoniciowego RNA, co zachodzi w wirusy onkogenne zawierające RNA.

Innym ważnym osiągnięciem biologii molekularnej było wyjaśnienie mechanizmu mutacji na poziomie molekularnym. W wyniku szeregu badań ustalono główne typy mutacji: duplikacje, inwersje, delecje, translokacje i transpozycje. Umożliwiło to rozważenie zmian ewolucyjnych z punktu widzenia procesów genowych i umożliwiło opracowanie teorii zegarów molekularnych, która jest wykorzystywana w filogenezie.

Na początku lat 70. sformułowano podstawowe zasady funkcjonowania kwasów nukleinowych i białek w żywym organizmie. Stwierdzono, że białka i kwasy nukleinowe w organizmie syntetyzowane są według mechanizmu macierzowego, cząsteczka macierzowa niesie zaszyfrowaną informację o sekwencji aminokwasów (w białku) lub nukleotydów (w kwasie nukleinowym). Podczas replikacji (podwojenia DNA) lub transkrypcji (syntezy mRNA) taką matrycą jest DNA, podczas translacji (synteza białek) lub odwrotnej transkrypcji - mRNA.

Stworzono więc teoretyczne przesłanki rozwoju stosowanych dziedzin biologii molekularnej, w szczególności inżynierii genetycznej. W 1972 roku Paul Berg, Herbert Bauer i Stanley Cohen opracowali technologię klonowania molekularnego. Wtedy jako pierwsi uzyskali rekombinowane DNA in vitro. Te wybitne eksperymenty położyły podwaliny pod inżynierię genetyczną, a ten rok jest uważany za datę narodzin tego kierunku naukowego.

W 1977 roku Frederick Sanger i niezależnie Allan Maxum i Walter Gilbert opracowali różne metody określania pierwotnej struktury (sekwencjonowania) DNA. Metoda Sangera, tzw. metoda terminacji łańcucha, jest podstawą współczesnej metody sekwencjonowania. Zasada sekwencjonowania opiera się na wykorzystaniu znakowanych zasad, które działają jako terminatory w cyklicznej reakcji sekwencjonowania. Ta metoda stała się powszechna ze względu na możliwość szybkiego przeprowadzenia analizy.

1976 - Fryderyk. Sanger rozszyfrował sekwencję nukleotydów DNA faga φΧ174 o długości 5375 par nukleotydów.

1981 – Anemia sierpowata staje się pierwszą chorobą genetyczną zdiagnozowaną na podstawie analizy DNA.

W latach 1982-1983 odkrycie katalitycznej funkcji RNA w amerykańskich laboratoriach T. Checka i S. Altmana zmieniło dotychczasowe wyobrażenia o wyłącznej roli białek. Przez analogię do białek katalitycznych - enzymów, katalityczne RNA nazwano rybozymami.

1987 Keri Mullez odkryła reakcję łańcuchową polimerazy, dzięki której możliwe jest sztuczne znaczne zwiększenie liczby cząsteczek DNA w roztworze do dalszych prac. Dziś jest to jedna z najważniejszych metod biologii molekularnej stosowana w badaniu chorób dziedzicznych i wirusowych, w badaniu genów oraz identyfikacji genetycznej i pokrewieństwa itp.

Jednocześnie w 1990 roku trzy grupy naukowców opublikowały metodę, która umożliwiła szybkie otrzymanie w laboratorium syntetycznych, aktywnych funkcjonalnie RNA (sztucznych rybozymów, czyli cząsteczek wchodzących w interakcje z różnymi ligandami - aptamerami). Ta metoda nazywa się „ewolucją in vitro”. A wkrótce potem, w latach 1991-1993 w laboratorium A.B. Chetverinie eksperymentalnie wykazano możliwość istnienia, wzrostu i amplifikacji cząsteczek RNA w postaci kolonii na podłożach stałych.

W 1998 roku, prawie jednocześnie, Craig Mello i Andrew Fire opisali mechanizm zaobserwowany wcześniej w eksperymentach genowych z bakteriami i kwiatami. interferencja RNA, w którym mała dwuniciowa cząsteczka RNA prowadzi do swoistej supresji ekspresji genów.

Odkrycie mechanizmu interferencji RNA ma ogromne znaczenie praktyczne dla współczesnej biologii molekularnej. Zjawisko to jest szeroko stosowane w eksperymentach naukowych jako narzędzie do „wyłączania”, czyli tłumienia ekspresji poszczególnych genów. Szczególnie interesujący jest fakt, że metoda ta pozwala na odwracalne (tymczasowe) tłumienie aktywności badanych genów. Trwają badania nad zastosowaniem tego zjawiska w leczeniu chorób wirusowych, nowotworowych, zwyrodnieniowych i metabolicznych. Należy zauważyć, że w 2002 roku odkryto mutanty wirusów polio, które mogą uniknąć interferencji RNA, więc opracowanie naprawdę skutecznych terapii opartych na tym zjawisku wymaga więcej żmudnej pracy.

W latach 1999-2001 kilka grup badaczy określiło strukturę rybosomu bakteryjnego z rozdzielczością od 5,5 do 2,4 angstremów.

Przedmiot

Trudno przecenić osiągnięcia biologii molekularnej w zakresie poznania przyrody żywej. Wielki sukces osiągnięto dzięki udanej koncepcji badawczej: złożone procesy biologiczne rozpatrywane są z punktu widzenia poszczególnych układów molekularnych, co umożliwia zastosowanie precyzyjnych fizykochemicznych metod badawczych. Przyciągało też wiele wielkich umysłów z dziedzin pokrewnych tej dziedzinie nauki: chemii, fizyki, cytologii, wirusologii, co również korzystnie wpłynęło na skalę i szybkość rozwoju wiedzy naukowej w tej dziedzinie. Tak znaczące odkrycia, jak określenie struktury DNA, rozszyfrowanie kodu genetycznego i sztuczna ukierunkowana modyfikacja genomu, pozwoliły znacznie głębiej zrozumieć specyfikę procesów rozwojowych organizmów i skutecznie rozwiązać wiele ważnych fundamentalnych i stosowane problemy naukowe, medyczne i społeczne, które jeszcze niedawno uważano za nierozwiązywalne.

Przedmiotem badań biologii molekularnej są głównie białka, kwasy nukleinowe i oparte na nich kompleksy molekularne (maszyny molekularne) oraz procesy, w których uczestniczą.

Kwasy nukleinowe to liniowe polimery składające się z jednostek nukleotydowych (związków pięcioczłonowego cukru z grupą fosforanową na piątym atomie cyklu i jedną z czterech zasad azotowych) połączonych ze sobą wiązaniem estrowym grup fosforanowych. Zatem kwas nukleinowy jest polimerem pentozofosforanowym z zasadami azotowymi jako podstawnikami bocznymi. Skład chemiczny łańcucha RNA różni się od DNA tym, że pierwszy składa się z pięcioczłonowego cyklu węglowodanowo-rybozowego, podczas gdy drugi składa się z dehydroksylowanej pochodnej rybozy, dezoksyrybozy. Jednocześnie cząsteczki te różnią się znacznie w przestrzeni, ponieważ RNA jest elastyczną cząsteczką jednoniciową, podczas gdy DNA jest cząsteczką dwuniciową.

Białka to liniowe polimery, które są łańcuchami alfa-aminokwasów połączonych ze sobą wiązaniem peptydowym, stąd ich druga nazwa - polipeptydy. W skład naturalnych białek wchodzi wiele różnych jednostek aminokwasowych – u człowieka do 20 – co decyduje o szerokiej gamie właściwości funkcjonalnych tych cząsteczek. Te lub inne białka biorą udział w prawie każdym procesie zachodzącym w organizmie i spełniają wiele zadań: pełnią rolę budulca komórkowego, zapewniają transport substancji i jonów, katalizują reakcje chemiczne – ta lista jest bardzo długa. Białka tworzą stabilne konformacje molekularne o różnych poziomach organizacji (struktury drugorzędowe i trzeciorzędowe) oraz kompleksy molekularne, co dodatkowo rozszerza ich funkcjonalność. Cząsteczki te mogą mieć wysoką specyficzność do wykonywania określonych zadań ze względu na tworzenie złożonej przestrzennej struktury kulistej. Szeroka gama białek zapewnia stałe zainteresowanie naukowców tego rodzaju cząsteczkami.

Współczesne poglądy na temat biologii molekularnej opierają się na uogólnieniu wysuniętym po raz pierwszy w 1958 roku przez Francisa Cricka jako centralny dogmat biologii molekularnej. Jej istotą było stwierdzenie, że informacja genetyczna w organizmach żywych przechodzi przez ściśle określone etapy realizacji: kopiowanie z DNA na DNA na wejściu dziedziczenia, z DNA na RNA, a następnie z RNA na białko, a przejście odwrotne nie jest możliwe. To stwierdzenie było prawdziwe tylko częściowo, dlatego później główny dogmat został poprawiony z uwzględnieniem nowo odkrytych danych.

W chwili obecnej istnieje kilka sposobów implementacji materiału genetycznego, reprezentujących różne sekwencje do realizacji trzech rodzajów istnienia informacji genetycznej: DNA, RNA i białka. W dziewięciu możliwych sposobach realizacji wyróżnia się trzy grupy: są to trzy przemiany ogólne (ogólne), które normalnie przeprowadzane są w większości organizmów żywych; trzy specjalne transformacje (specjalne), przeprowadzane w niektórych wirusach lub w specjalnych warunkach laboratoryjnych; trzy nieznane transformacje (nieznane), których realizacja jest uważana za niemożliwą.

Typowe transformacje obejmują następujące sposoby implementacji kodu genetycznego: DNA→DNA (replikacja), DNA→RNA (transkrypcja), RNA→białko (translacja).

Aby przeprowadzić transfer cech dziedzicznych, rodzice muszą przekazać swoim potomkom pełnoprawną cząsteczkę DNA. Proces, w którym można zsyntetyzować dokładną kopię oryginalnego DNA, a tym samym przenieść materiał genetyczny, nazywa się replikacją. Dokonują tego specjalne białka, które rozplatają cząsteczkę (prostują jej odcinek), rozwijają podwójną helisę i za pomocą polimerazy DNA tworzą dokładną kopię oryginalnej cząsteczki DNA.

Aby zapewnić życie komórce, musi ona stale odwoływać się do kodu genetycznego wbudowanego w podwójną helisę DNA. Cząsteczka ta jest jednak zbyt duża i nieporęczna, aby mogła służyć jako bezpośrednie źródło materiału genetycznego do ciągłej syntezy białek. Dlatego w trakcie implementacji informacji zapisanej w DNA następuje etap pośredni: synteza mRNA, czyli małej jednoniciowej cząsteczki komplementarnej do pewnego odcinka DNA kodującego określone białko. Proces transkrypcji zapewnia polimeraza RNA i czynniki transkrypcyjne. Powstała cząsteczka może być następnie łatwo dostarczona do części komórki odpowiedzialnej za syntezę białek – rybosomu.

Po wejściu RNA do rybosomu rozpoczyna się końcowy etap realizacji informacji genetycznej. W tym przypadku rybosom odczytuje kod genetyczny z mRNA w trojaczkach zwanych kodonami i syntetyzuje odpowiednie białko na podstawie otrzymanych informacji.

W trakcie specjalnych przekształceń kod genetyczny jest realizowany według schematu RNA → RNA (replikacja), RNA → DNA (odwrotna transkrypcja), DNA → białko (translacja bezpośrednia). Replikacja tego typu jest realizowana w wielu wirusach, gdzie jest przeprowadzana przez enzym RNA-zależną polimerazę RNA. Podobne enzymy znajdują się również w komórkach eukariotycznych, gdzie są związane z procesem wyciszania RNA. Odwrotną transkrypcję stwierdzono w retrowirusach, gdzie jest przeprowadzana przez enzym odwrotną transkryptazę, aw niektórych przypadkach w komórkach eukariotycznych, na przykład podczas syntezy telomeru. Transmisja na żywo odbywa się wyłącznie w sztucznych warunkach w izolowanym systemie poza komórką.

Każde z trzech możliwych przejść informacji genetycznej z białka na białko, RNA lub DNA jest uważane za niemożliwe. Przypadek działania prionów na białka, w wyniku którego powstaje podobny prion, można warunkowo przypisać rodzajowi realizacji informacji genetycznej białko → białko. Jednak formalnie tak nie jest, ponieważ nie wpływa na sekwencję aminokwasową w białku.

Ciekawa jest historia powstania terminu „dogmat centralny”. Ponieważ słowo dogmat generalnie oznacza stwierdzenie niepodlegające wątpliwości, a samo słowo ma wyraźną konotację religijną, wybór go jako opisu faktu naukowego nie jest do końca uzasadniony. Według samego Francisa Cricka był to jego błąd. Chciał nadać wysuniętej teorii większe znaczenie, wyróżnić ją na tle innych teorii i hipotez; dlaczego zdecydował się użyć tego majestatycznego, jego zdaniem, słowa, nie rozumiejąc jego prawdziwego znaczenia. Nazwa jednak została.

Biologia molekularna dzisiaj

Szybki rozwój biologii molekularnej, stałe zainteresowanie społeczeństwa osiągnięciami w tej dziedzinie oraz obiektywne znaczenie badań doprowadziły do ​​powstania dużej liczby dużych ośrodków badawczych biologii molekularnej na całym świecie. Wśród największych wymienić należy: laboratorium biologii molekularnej w Cambridge, Royal Institute w Londynie – w Wielkiej Brytanii; instytuty biologii molekularnej w Paryżu, Marsylii i Strasburgu, Instytut Pasteura – we Francji; wydziały biologii molekularnej Uniwersytetu Harvarda i Massachusetts Institute of Technology, University of Berkeley, California Institute of Technology, Rockefeller University, Institute of Public Health w Bethesda – w USA; instytuty Maxa Plancka, uniwersytety w Getyndze i Monachium, Centralny Instytut Biologii Molekularnej w Berlinie, instytuty w Jenie i Halle – w Niemczech; Karolinska Institute w Sztokholmie, Szwecja.

W Rosji wiodącymi ośrodkami w tej dziedzinie są Instytut Biologii Molekularnej. Instytut Genetyki Molekularnej RAŚ, Instytut Biologii Genów RAŚ, Instytut Biologii Fizykochemicznej im. V.A. A. N. Belozersky Moskiewski Uniwersytet Państwowy. Instytut Biochemii MV Łomonosowa. A.N.Bach RAS i Instytut Białka RAS w Pushchino.

Dzisiejsze pole zainteresowań biologów molekularnych obejmuje szeroki zakres podstawowych zagadnień naukowych. Tak jak poprzednio, wiodącą rolę zajmuje badanie struktury kwasów nukleinowych i biosyntezy białek, badanie struktury i funkcji różnych struktur wewnątrzkomórkowych i powierzchni komórek. Ważnymi obszarami badań są również badania mechanizmów odbioru i transmisji sygnałów, molekularnych mechanizmów transportu związków w obrębie komórki, a także z komórki do środowiska zewnętrznego iz powrotem. Wśród głównych kierunków badań naukowych z zakresu stosowanej biologii molekularnej jednym z najbardziej priorytetowych jest problem powstawania i rozwoju nowotworów. Również bardzo ważnym obszarem, którym zajmuje się Zakład Biologii Molekularnej – genetyki molekularnej, jest badanie molekularnych podstaw występowania chorób dziedzicznych oraz chorób wirusowych, takich jak AIDS, a także opracowywanie metod ich profilaktyka i ewentualnie leczenie na poziomie genów. Odkrycia i osiągnięcia biologów molekularnych w medycynie sądowej znalazły szerokie zastosowanie. Prawdziwej rewolucji w dziedzinie identyfikacji osobowej dokonali w latach 80. naukowcy z Rosji, USA i Wielkiej Brytanii dzięki opracowaniu i wdrożeniu metody „genomic fingering” – identyfikacji DNA w codziennej praktyce. Badania w tej dziedzinie nie kończą się do dziś, nowoczesne metody pozwalają ustalić osobę z prawdopodobieństwem błędu wynoszącym jedną miliardową procenta. Już teraz aktywnie rozwija się projekt paszportu genetycznego, który zgodnie z oczekiwaniami znacznie obniży poziom przestępczości.

Metodologia

Dziś biologia molekularna dysponuje obszernym arsenałem metod rozwiązywania najbardziej zaawansowanych i najbardziej złożonych problemów, z jakimi borykają się naukowcy.

Jedna z najpowszechniejszych metod w biologii molekularnej jest elektroforeza żelowa, co rozwiązuje problem rozdzielania mieszaniny makrocząsteczek według wielkości lub ładunku. Niemal zawsze po rozdzieleniu makrocząsteczek w żelu stosuje się blotting, metodę pozwalającą na przeniesienie makrocząsteczek z żelu (sorb) na powierzchnię membrany dla wygody dalszej pracy z nimi, w szczególności hybrydyzacji. Hybrydyzacja - tworzenie hybrydowego DNA z dwóch nici o różnym charakterze - metoda, która odgrywa ważną rolę w badaniach podstawowych. Służy do ustalenia uzupełniający segmentów w różnych DNA (DNA różnych gatunków), służy do poszukiwania nowych genów, przy jego pomocy odkryto interferencję RNA, a jego zasada stała się podstawą genomowego odcisku palca.

Ważną rolę we współczesnej praktyce badań biologii molekularnej odgrywa metoda sekwencjonowania - określania sekwencji nukleotydów w kwasach nukleinowych i aminokwasów w białkach.

Współczesnej biologii molekularnej nie można sobie wyobrazić bez metody reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Dzięki tej metodzie przeprowadza się zwiększenie liczby (amplifikacji) kopii określonej sekwencji DNA w celu uzyskania z jednej cząsteczki wystarczającej ilości substancji do dalszej pracy z nią. Podobny efekt uzyskuje się dzięki technologii klonowania molekularnego, w której do DNA bakterii (systemów żywych) wprowadza się wymaganą sekwencję nukleotydów, po czym namnażanie bakterii prowadzi do pożądanego rezultatu. Podejście to jest technicznie znacznie bardziej skomplikowane, ale pozwala jednocześnie uzyskać wynik ekspresji badanej sekwencji nukleotydowej.

Również metody ultrawirowania (do rozdzielania makrocząsteczek (w dużych ilościach), komórek, organelli), mikroskopia elektronowa i fluorescencyjna, metody spektrofotometryczne, analiza dyfrakcji rentgenowskiej, autoradiografia itp. są szeroko stosowane w badaniach biologii molekularnej.

Dzięki postępowi technologicznemu i badaniom naukowym z zakresu chemii, fizyki, biologii i informatyki, nowoczesna aparatura umożliwia izolowanie, badanie i zmianę poszczególnych genów oraz procesów, w których biorą udział.

Pokrótce przypomnę tzw centralny dogmat biologii molekularnej, pierwotnie sformułowany przez Francisa Cricka. Ogólnie stwierdza się, że informacja genetyczna jest przenoszona z kwasów nukleinowych do białek podczas implementacji, ale nie odwrotnie. Dokładniej, możliwe jest przeniesienie DNA → DNA ( replikacja), DNA → RNA ( transkrypcja) i RNA → białko ( audycja). Istnieją również znacznie mniej powszechne sposoby charakterystyczne dla niektórych wirusów: RNA → DNA ( transkrypcja odwrotna) i RNA → RNA ( replikacja RNA). Przypomnę również, że białka składają się z reszt aminokwasowych, których sekwencja jest zakodowana w kodzie genetycznym organizmu: trzech nukleotydów (nazywane są kodon, lub tryplet) kodują jeden aminokwas, a ten sam aminokwas może być kodowany przez kilka kodonów.

W drugiej połowie XX wieku rozwinęła się technologia rekombinowane DNA(czyli metody manipulacji DNA, które umożliwiają zmianę sekwencji i składu nukleotydów w cząsteczce na różne sposoby). To na ich podstawie do dziś rozwijane są wszystkie metody biologii molekularnej, choć stały się one znacznie bardziej złożone, zarówno ideologicznie, jak i technologicznie. To właśnie biologia molekularna spowodowała tak szybki wzrost ilości informacji biologicznej w ciągu ostatniego półwiecza.

Opowiem o metodach manipulowania i badania DNA i RNA oraz trochę poruszę temat białek, ponieważ generalnie związane z nimi metody są bliższe biochemii niż biologii molekularnej (chociaż granica między nimi ostatnio bardzo się zatarła) .

Cięcie i szycie

Enzymy to białka przyspieszające reakcje chemiczne. Są bardzo wydajne: przyspieszenie może sięgać kilku rzędów wielkości! Na przykład enzym katalaza, rozszczepiając nadtlenek wodoru, przyspiesza reakcję o około 12 rzędów wielkości, czyli bilion razy! Jednocześnie nieorganiczny katalizator - drobno zdyspergowana platyna - przyspiesza tę samą reakcję tylko o sześć rzędów wielkości, czyli milion razy. Odbywa się to jednak kosztem bardzo surowych warunków pracy dla większości z nich.

Endonukleazy restrykcyjne

Rysunek 2. Miejsca z ograniczeniami. Powyżej sma Ja, podczas pracy której powstają „tępe” końce. Dno- docelowa sekwencja enzymu restrykcyjnego eko RI, podczas którego powstają „lepkie” końcówki.

Jednym z pierwszych i najważniejszych kroków w biologii molekularnej była umiejętność cięcia cząsteczek DNA i to w ściśle określonych miejscach. Metoda ta została wynaleziona podczas badań w latach 50.-70. XX wieku nad takim zjawiskiem: niektóre rodzaje bakterii, po dodaniu obcego DNA do środowiska, zniszczyły je, podczas gdy ich własne DNA pozostało nienaruszone. Okazało się, że używają do tego enzymów, później tzw nukleazy restrykcyjne lub restrykcje. Istnieje wiele rodzajów ograniczeń: do 2007 roku znanych było ponad 3000. Ważną właściwością każdego takiego enzymu jest jego zdolność do cięcia ściśle określonego - cel- Sekwencja nukleotydowa DNA (ryc. 2). Enzymy restrykcyjne nie wpływają na własne DNA komórki, ponieważ nukleotydy w sekwencjach docelowych są zmodyfikowane w taki sposób, że enzym restrykcyjny nie może z nimi pracować. (To prawda, czasami wręcz przeciwnie, mogą ciąć tylko zmodyfikowane sekwencje - do zwalczania tych, którzy modyfikują DNA, chroniąc się przed powyższymi enzymami restrykcyjnymi.) Ze względu na to, że docelowe sekwencje mają różną długość, częstotliwość ich występowania w cząsteczkach DNA jest różna: im dłuższy wymagany fragment, tym mniejsze prawdopodobieństwo ma się pojawić. Odpowiednio, fragmenty DNA utworzone podczas traktowania różnymi restrykcjami będą miały różną długość.

Do dziś odkrywane są nowe endonukleazy. Wiele z nich nie zostało jeszcze sklonowanych, to znaczy geny, które je kodują, nie są znane, a pewna oczyszczona frakcja białek o niezbędnej aktywności katalitycznej jest wykorzystywana jako „enzym”. Nowosybirska firma SibEnzyme od dłuższego czasu z powodzeniem konkuruje z New England Biolabs, światowym liderem w dostarczaniu restryktaz (to znaczy oferowała te same lub więcej różnych restryktaz, z których część jest bardzo egzotyczna). - wyd.

Za wyizolowanie pierwszego enzymu restrykcyjnego, badanie jego właściwości i pierwsze zastosowanie do mapowania chromosomów Werner Arber ( Wernera Arbera), Dan Nathans ( Dan Nathans) i Hamiltona Smitha ( Hamiltona Smitha) w 1978 roku otrzymał Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii lub medycyny.

ligazy DNA

Aby tworzyć nowe cząsteczki DNA, oczywiście oprócz cięcia konieczna jest również umiejętność łączenia ze sobą dwóch nici. Odbywa się to za pomocą enzymów tzw ligazy DNA które sieciują szkielet cukrowo-fosforanowy dwóch nici DNA. Ponieważ struktura chemiczna DNA nie różni się między organizmami, można krzyżować DNA z dowolnego źródła, a komórka nie będzie w stanie odróżnić powstałej cząsteczki od własnego DNA.

Rozdzielanie cząsteczek DNA: elektroforeza żelowa

Często masz do czynienia z mieszaniną cząsteczek DNA o różnej długości. Na przykład podczas obróbki DNA chemicznie wyizolowanego z organizmu za pomocą enzymów restrykcyjnych otrzymana zostanie mieszanina fragmentów DNA, a ich długości będą różne.

Ponieważ każda cząsteczka DNA w roztworze wodnym jest naładowana ujemnie, możliwe staje się rozdzielenie mieszaniny fragmentów DNA o różnych rozmiarach wzdłuż ich długości za pomocą elektroforeza, . DNA umieszcza się na żelu (zwykle agarozie w przypadku stosunkowo długich i bardzo różnych cząsteczek lub poliakryloamidzie w przypadku elektroforezy o wysokiej rozdzielczości), który umieszcza się w stałym polu elektrycznym. Z tego powodu cząsteczki DNA będą przemieszczać się w kierunku elektrody dodatniej ( anoda), a ich prędkości będą zależeć od długości cząsteczki: im dłuższa, tym bardziej żel zapobiega jej poruszaniu się, a tym samym mniejsza prędkość. Po elektroforezie mieszaniny fragmentów o różnej długości w żelu tworzą prążki odpowiadające fragmentom o tej samej długości. Za pomocą markerów (mieszanin fragmentów DNA o znanej długości) można określić długość cząsteczek w próbce (ryc. 3).

Istnieją dwa sposoby wizualizacji wyników forezy. Pierwszym, najczęściej stosowanym ostatnio, jest dodanie do żelu substancji fluoryzujących w obecności DNA (tradycyjnie stosowano raczej toksyczny bromek etydyny, ostatnio zaczęto stosować bezpieczniejsze substancje). Bromek etydyny świeci na pomarańczowo po naświetleniu światłem ultrafioletowym, a po związaniu z DNA intensywność luminescencji wzrasta o kilka rzędów wielkości (ryc. 4). Inną metodą jest wykorzystanie izotopów promieniotwórczych, które muszą najpierw znaleźć się w analizowanym DNA. W tym przypadku kliszę fotograficzną umieszcza się na wierzchu żelu, który jest oświetlany nad prążkami DNA w wyniku promieniowania radioaktywnego (ta metoda obrazowania nazywa się autoradiografia).

Rycina 4. Elektroforeza w żelu agarozowym użycie bromku etydyny do wizualizacji wyników w ultrafiolecie ( lewy). Drugi ślad od lewej to znacznik ze znanymi długościami fragmentów. Po prawej- Instalacja do elektroforezy w żelu.

Oprócz „zwykłej” elektroforezy w płytce żelowej, w niektórych przypadkach używają elektroforeza kapilarna, który przeprowadza się w bardzo cienkiej rurce wypełnionej żelem (zwykle poliakrylamidem). Rozdzielczość takiej elektroforezy jest znacznie wyższa: można ją stosować do rozdzielania cząsteczek DNA różniących się długością tylko jeden nukleotyd. Przeczytaj o jednym z ważnych zastosowań tej metody poniżej w opisie metody sekwencjonowania DNA Sangera.

Identyfikacja określonej sekwencji DNA w mieszaninie. Southern blotting

Za pomocą elektroforezy możesz dowiedzieć się, jaki jest rozmiar cząsteczek DNA w roztworze, ale nic ci to nie powie o sekwencji nukleotydów w nich zawartych. Używając hybrydyzacja DNA można zrozumieć, który z prążków zawiera fragment z ściśle określone sekwencja. Hybrydyzacja DNA opiera się na tworzeniu wiązań wodorowych pomiędzy dwiema nićmi DNA, co prowadzi do ich połączenia.

Najpierw musisz zsyntetyzować sonda DNA, która jest komplementarna do szukanej sekwencji. Zwykle jest to jednoniciowa cząsteczka DNA o długości 10–1000 nukleotydów. Dzięki komplementarności sonda zwiąże się z pożądaną sekwencją, a dzięki znacznikowi fluorescencyjnemu lub radioizotopom osadzonym w sondzie wyniki będą widoczne.

W tym celu procedura tzw Southern blotting lub Przeniesienie z południa, nazwany na cześć naukowca, który go wynalazł ( Edwin Południowy). Początkowo mieszaninę fragmentów DNA rozdziela się za pomocą elektroforezy. Arkusz nitrocelulozy lub nylonu umieszcza się na wierzchu żelu, a oddzielone fragmenty DNA przenosi się na niego przez bibułę: żel leży na gąbce w kąpieli z roztworem alkalicznym, który przesącza się przez żel i nitrocelulozę z powodu kapilary efekt ręczników papierowych złożonych na wierzchu. Podczas wycieku alkalia powodują denaturację DNA, a już jednoniciowe fragmenty są przenoszone na powierzchnię płytki nitrocelulozowej i tam utrwalane. Arkusz nitrocelulozy jest ostrożnie usuwany z żelu i traktowany znakowaną radioaktywnie sondą DNA specyficzną dla wymaganej sekwencji DNA. Arkusz nitrocelulozowy jest dokładnie myty, tak aby pozostały na nim tylko te cząsteczki próbki, które hybrydyzują z DNA na nitrocelulozie. Po autoradiografii DNA, z którym sonda hybrydyzowała, będzie widoczne jako prążki na kliszy fotograficznej (ryc. 5).

Adaptacja tej techniki do określania określonych sekwencji RNA nazywana jest, w przeciwieństwie do Southern blotting, Northern blotting (northern blotting: południowy w języku angielskim oznacza „południowy” i północny- „północny”). W tym przypadku elektroforezę przeprowadza się w żelu z cząsteczkami mRNA, a jako sondę wybiera się jednoniciową cząsteczkę DNA lub RNA.

klonowanie DNA

Wiemy już, jak pociąć genom na części (i zszyć je z dowolnymi cząsteczkami DNA), podzielić powstałe fragmenty wzdłuż długości i wybrać potrzebny za pomocą hybrydyzacji. Teraz nadszedł czas, aby dowiedzieć się, w jaki sposób, łącząc te metody, możemy sklonować fragment genomu (na przykład określony gen). W genomie każdy gen zajmuje niezwykle małą długość (w porównaniu z całym DNA komórki). klonowanie DNA dosłownie oznacza stworzenie dużej liczby kopii pewnego jego fragmentu. To właśnie przez to wzmocnienie mamy możliwość wyizolowania fragmentu DNA i uzyskania go w ilości wystarczającej do badań.

Sposób dzielenia fragmentów DNA według długości i identyfikowania pożądanego opisano powyżej. Teraz musimy zrozumieć, w jaki sposób możemy skopiować potrzebny nam fragment. Istnieją dwie główne metody: wykorzystanie szybko dzielących się organizmów (zwykle bakterii Escherichia coli- Escherichia coli - lub drożdże Saccharomyces serevisiae) lub wykonaj podobny proces, ale in vitro używając reakcja łańcuchowa polimerazy.

replikacja w bakteriach

Ponieważ bakterie (jak każda inna komórka, z wyjątkiem prekursorów komórek zarodkowych) podwajają swoje DNA przy każdym podziale komórki, można to wykorzystać do pomnożenia liczby potrzebujemy DNA. W celu wprowadzenia naszego fragmentu DNA do bakterii konieczne jest „wszycie” go w specjalny wektor, który zwykle wykorzystywany jest jako plazmid(mała - w stosunku do chromosomu bakteryjnego - kolista cząsteczka DNA, która replikuje się oddzielnie od chromosomu). Bakterie typu dzikiego często mają podobne struktury: często są przenoszone „poziomo” między różnymi szczepami lub nawet gatunkami bakterii. Najczęściej zawierają geny oporności na antybiotyki (to właśnie dzięki tej właściwości zostały odkryte) lub bakteriofagi, a także geny umożliwiające komórce wykorzystanie bardziej zróżnicowanego substratu. (Czasami są one „samolubne” i nie pełnią żadnych funkcji.) To właśnie te plazmidy są zwykle wykorzystywane w badaniach genetyki molekularnej. Plazmidy koniecznie zawierają początek replikacji (sekwencję, od której rozpoczyna się replikacja cząsteczki), sekwencję docelową enzymu restrykcyjnego oraz gen umożliwiający selekcję tych komórek, które mają ten plazmid (zwykle są to geny odporności na jakiś antybiotyk). W niektórych przypadkach (na przykład podczas badania bardzo dużych fragmentów DNA) nie stosuje się plazmidu, ale sztuczny chromosom bakteryjny.

Niezbędny fragment DNA wprowadza się do plazmidu za pomocą enzymów restrykcyjnych i ligaz, po czym dodaje się go do hodowli bakteryjnej w specjalnych warunkach, które zapewniają transformacja- proces aktywnego wychwytywania DNA ze środowiska zewnętrznego przez bakterię (ryc. 6). Następnie selekcjonuje się bakterie, których transformacja zakończyła się sukcesem, poprzez dodanie antybiotyku odpowiadającego genowi w plazmidzie: tylko komórki niosące gen oporności (a co za tym idzie plazmid) pozostają żywe. Ponadto, po wzroście hodowli komórkowej, izolowane są z niej plazmidy, z których „nasz” fragment DNA jest izolowany za pomocą restryktaz (lub wykorzystuję cały plazmid). Jeżeli gen został wstawiony do plazmidu w celu uzyskania jego produktu białkowego, konieczne jest zapewnienie hodowli warunków do wzrostu, a następnie po prostu wyizolowanie potrzebnego białka.

W tym miejscu od razu powinno pojawić się pytanie: jak można było to wszystko wykorzystać, zanim genomy zostały rozszyfrowane, a odczytanie sekwencji DNA było jeszcze drogie i nie było powszechne? Załóżmy, że za pomocą restrykcji i klonowania otrzymanych fragmentów otrzymujemy biblioteka DNA, czyli zestaw bakterii niosących różne plazmidy zawierające w sumie cały genom (lub zauważalną jego część). Ale jak możemy zrozumieć, który z fragmentów zawiera niezbędny gen? W tym celu zastosowano metodę hybrydyzacji. Najpierw należało wyizolować białko pożądanego genu. Następnie sekwencjonuje się jego fragment, odwraca się kod genetyczny i uzyskuje się sekwencję nukleotydów (oczywiście ze względu na degenerację kodu genetycznego trzeba było wypróbować wiele różnych opcji). Zgodnie z nią chemicznie zsyntetyzowano krótką cząsteczkę DNA, która posłużyła jako sonda do hybrydyzacji.

Ale w niektórych przypadkach ta metoda zawiodła - na przykład stało się tak z czynnikiem krzepnięcia krwi VIII. Białko to bierze udział w krzepnięciu krwi, a nieprawidłowości w jego funkcjonowaniu są przyczyną jednej z najczęstszych chorób genetycznych – hemofilii typu A. Wcześniej do leczenia białko to musiało być izolowane z dużej liczby organizmów, ponieważ nie mogło sklonować do produkcji przez bakterie. Wynikało to z faktu, że jego długość wynosi około 180 000 par zasad i zawiera wiele intronów (fragmentów niekodujących pomiędzy fragmentami kodującymi) – nic dziwnego, że gen ten nie dostał się w całości do żadnego plazmidu.

O mechanizmach krzepnięcia krwi patrz „ Jak działa krzepnięcie krwi? ». - Ed.

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)

Metoda opiera się na wielokrotnym selektywnym kopiowaniu określonego segmentu DNA przy pomocy enzymów w sztucznych warunkach. W tym przypadku kopiowany jest tylko ten segment DNA, który spełnia określone warunki i tylko jeśli jest obecny w badanej próbce. W przeciwieństwie do replikacji DNA w komórkach żywych organizmów, stosunkowo krótkie odcinki DNA amplifikuje się metodą PCR (zwykle nie więcej niż 3000 par zasad, ale istnieją metody, które pozwalają „podnieść” nawet do 20 tysięcy par zasad – tzw. PCR dalekiego zasięgu).

W rzeczywistości PCR jest sztuczną wielokrotną replikacją fragmentu DNA (ryc. 7). Polimerazy DNA są zaprojektowane w taki sposób, że nie mogą syntetyzować nowego DNA po prostu mając dostęp do matrycy i monomerów. Aby to zrobić, potrzebujesz również nasion ( Elementarz) od którego rozpoczynają syntezę. Starter to krótki, jednoniciowy fragment kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do matrycy DNA. Podczas replikacji w komórce takie startery są syntetyzowane przez specjalny enzym prymas i są cząsteczkami RNA, które później są zastępowane przez DNA. Jednak w PCR stosuje się sztucznie syntetyzowane cząsteczki DNA, ponieważ w tym przypadku etap usuwania RNA i syntezy DNA w ich miejsce nie jest potrzebny. W PCR startery ograniczają zamplifikowany region po obu stronach.

Rycina 7. Replikacja DNA- najważniejszy proces dla organizmów żywych, podstawa wielu metod biologii molekularnej. Ponieważ każdy z łańcuchów DNA zawiera sekwencję nukleotydów, która jest komplementarna do drugiego łańcucha (ich zawartość informacyjna jest taka sama), gdy DNA jest duplikowany, łańcuchy rozchodzą się, a następnie każdy łańcuch służy jako szablon, na którym nowy łańcuch DNA budowany jest komplementarnie do niego. W efekcie powstają dwa dupleksy DNA, z których każdy jest dokładną (bez uwzględnienia błędów syntezy) kopią oryginalnej cząsteczki.

Czas więc wyjaśnić, jak działa PCR. Początkowo mieszanina reakcyjna zawiera: matrycę DNA, startery, polimerazę DNA, wolne nukleozydy (przyszłe „litery” w nowo syntetyzowanym DNA), a także kilka innych substancji poprawiających działanie polimerazy (dodawane są do specjalnych buforów użyte w reakcji).

Aby zsyntetyzować DNA komplementarne do matrycy, konieczne jest, aby jeden ze starterów utworzył z nim wiązania wodorowe (jak to się mówi, „wyżarzanie” na nim). Ale matrix tworzy je już z drugim łańcuchem! Więc najpierw musisz stopić DNA - czyli zniszczyć wiązania wodorowe. Odbywa się to poprzez proste podgrzanie (do ≈95°C) – etap tzw denaturacja. Ale teraz podkłady nie mogą palić się na matrycy ze względu na wysoką temperaturę! Następnie obniża się temperaturę (50–65°C), podkłady poddaje się wyżarzaniu, po czym temperaturę nieznacznie podwyższa się (do optymalnej pracy polimerazy, zwykle około 72°C). I wtedy polimeraza zaczyna syntetyzować łańcuchy DNA komplementarne do matrycy – jest to tzw wydłużenie(Rys. 8). Po jednym takim cyklu liczba kopii wymaganych fragmentów podwoiła się. Nic jednak nie stoi na przeszkodzie, aby zrobić to ponownie. I to nie raz, a dziesiątki razy! A z każdym powtórzeniem liczba kopii naszego fragmentu DNA podwoi się, ponieważ nowo zsyntetyzowane cząsteczki będą jednocześnie służyć jako matryce (ryc. 9)! (W rzeczywistości wydajność PCR rzadko jest tak wysoka, jak liczba kopii debel, ale w idealnym przypadku tak jest, a liczby rzeczywiste są często zbliżone do tego).

Rycina 9. Z każdym cyklem PCR ilość docelowego DNA podwaja się.

Bardzo łatwo jest zobaczyć wyniki PCR: wystarczy przeprowadzić elektroforezę mieszaniny reakcyjnej po PCR, a widoczny będzie jasny prążek z otrzymanymi kopiami.

Wcześniej polimeraza inaktywowana termicznie musiała być dodawana cały czas z każdym cyklem, ale wkrótce zaproponowano zastosowanie termostabilnej polimerazy z bakterii termofilnych, która może wytrzymać takie ciepło, co znacznie upraszcza PCR (najczęściej stosowaną polimerazę Taq z bakterii Termus wodny ).

Aby uniknąć silnego odparowania wody z mieszaniny reakcyjnej, dodaje się olej tak, aby przykryć ją od góry i/lub stosuje się podgrzewaną pokrywę. termocykler- urządzenie, w którym przeprowadza się PCR. Szybko zmienia temperaturę probówek i nie muszą one ciągle przełączać się z jednego termostatu na drugi. Aby zapobiec niespecyficznej syntezie jeszcze przed ogrzewaniem i właściwym rozpoczęciem cykli, często stosuję PCR z „gorącym startem”: całe DNA i polimeraza są oddzielone od siebie warstwą parafiny, która topi się w wysokiej temperaturze i pozwala interakcję już w odpowiednich warunkach. Czasami stosuje się zmodyfikowane polimerazy, które nie działają w niskich temperaturach.

O różnych subtelnościach PCR można powiedzieć znacznie więcej, ale najważniejszą rzeczą do powiedzenia są alternatywne metody określania wyników w stosunku do klasycznej forezy. Na przykład dość oczywistą opcją jest dodanie do probówki reakcyjnej substancji fluoryzujących w obecności DNA przed rozpoczęciem reakcji. Następnie, porównując początkową fluorescencję z końcową, można zobaczyć, czy zsyntetyzowano znaczną ilość DNA, czy nie. Ale ta metoda nie jest specyficzna: nie będziemy w stanie w żaden sposób ustalić, czy niezbędny fragment, czy też jakieś startery sklejają się i tworzą nieprzewidywalne sekwencje.

Najciekawszą opcją jest PCR „w czasie rzeczywistym” („real-time PCR”). Istnieje kilka implementacji tej metody, ale idea jest wszędzie taka sama: można bezpośrednio obserwować gromadzenie się produktów PCR (poprzez fluorescencję) podczas reakcji. W związku z tym PCR w czasie rzeczywistym wymaga specjalnego urządzenia, które może wzbudzać i odczytywać fluorescencję w każdej probówce. Najprostszym rozwiązaniem jest dodanie do probówki tych samych substancji, które fluoryzują w obecności DNA, ale wady tej metody zostały już opisane powyżej.

Jest to ściśle określane jako „PCR fluorescencyjny w czasie rzeczywistym” lub „ilościowy PCR”. - Ed.

Rysunek 11. Przykład krzywych akumulacji fluorescencji w PCR w czasie rzeczywistym: zależność intensywności fluorescencji (w kilku probówkach - dla każdej własnej krzywej) od liczby cykli.

Najbardziej popularną implementacją tego podejścia jest metoda cięcia fluoroforu w wyniku zniszczenia sondy (TaqMan Assay; ryc. 10). W takim przypadku mieszanina reakcyjna powinna zawierać jeszcze jeden składnik – specjalną jednoniciową sondę DNA: cząsteczkę DNA komplementarną do sekwencji amplifikowanego fragmentu, zlokalizowaną pomiędzy podkłady. Jednocześnie jeden z jego końców powinien być połączony chemicznie fluorofor(cząsteczka fluorescencyjna), a do drugiej wygaszacz (cząsteczka absorbująca energię fluoroforu i „wygaszająca” fluorescencję). Gdy taka sonda jest w roztworze lub jest komplementarna do sekwencji docelowej, fluorofor i wygaszacz znajdują się stosunkowo blisko siebie i nie obserwuje się fluorescencji. Jednak ze względu na aktywność 3´-egzonukleazy, jaką posiada polimeraza Taq (to znaczy rozszczepia DNA, na które „natyka się” podczas syntezy i syntetyzuje w jego miejsce nowy), sonda ulega zniszczeniu podczas syntezy drugiego nić, fluorofor i wygaszacz w wyniku dyfuzji oddalają się od siebie i pojawia się fluorescencja.

Ponieważ liczba kopii wzrasta wykładniczo podczas PCR, rośnie również fluorescencja. Nie trwa to jednak długo, gdyż w pewnym momencie wydajność reakcji zaczyna spadać z powodu stopniowej inaktywacji polimerazy, braku niektórych składników itp. (ryc. 11). Analizując wykresy wzrostu fluorescencji, można wiele zrozumieć na temat procesu PCR, ale przede wszystkim dowiedzieć się, ile szablonów DNA było oryginalnie: jest to tzw. ilościowy PCR(ilościowa PCR, qPCR).

Nie sposób wymienić wszystkich zastosowań PCR w nauce. Izolacja fragmentu DNA, sekwencjonowanie, mutageneza... PCR to jedna z najpopularniejszych metod do celów pozanaukowych (wideo 1). Jest szeroko stosowany w medycynie do wczesnej diagnostyki chorób dziedzicznych i zakaźnych, ustalania ojcostwa, w badaniach ustalających tożsamość i wielu innych.

Naturalne procesy komórkowe in vitro

Wszystkie główne procesy biologii molekularnej można łatwo przeprowadzić in vitro(czyli w probówce). Przykład podano powyżej: PCR jest analogiczne do replikacji DNA. W tym celu wystarczy wymieszać niezbędne odczynniki w odpowiednich warunkach: transkrypcja wymaga matrycy DNA, polimerazy RNA i rybonukleotydów, translacja wymaga mRNA, podjednostek rybosomów i aminokwasów, odwrotna transkrypcja wymaga matrycy RNA, odwrotna transkryptaza(inaczej rewertaza) i dezoksyrybonukleotydy. Metody te znajdują szerokie zastosowanie w różnych dziedzinach biologii, gdy konieczne jest np. uzyskanie czystego RNA określonego genu. W takim przypadku musisz najpierw odwrócić transkrypcję jego (genu) mRNA, zamplifikować go za pomocą PCR, a następnie użyć in vitro- transkrypcji uzyskać dużo mRNA. Pierwszy etap jest konieczny ze względu na fakt, że przed powstaniem dojrzałego mRNA w komórce, splatanie oraz przetwarzanie RNA (u eukariontów; u bakterii w tym sensie wszystko jest prostsze) - przygotowanie do pracy jako matryca do syntezy białek. Czasami można tego uniknąć, jeśli cała sekwencja kodująca genu jest zlokalizowana w jednym eksonie.

sekwencjonowanie DNA

Można powiedzieć, że najważniejsze metody manipulowania DNA zostały już opisane. Kolejnym krokiem jest określenie rzeczywistej sekwencji nukleotydów łańcucha w cząsteczce - sekwencjonowanie. Określenie sekwencji nukleotydów DNA jest niezwykle ważne dla wielu podstawowych i aplikacyjnych problemów. Zajmuje szczególne miejsce w nauce: aby analizować wyniki sekwencjonowania genomu, w rzeczywistości stworzono nową naukę - bioinformatyka. Sekwencjonowanie jest obecnie używane przez biologów molekularnych, genetyków, biochemików, mikrobiologów, botaników i zoologów oraz oczywiście ewolucjonistów: prawie cała współczesna systematyka opiera się na jego wynikach. Sekwencjonowanie jest szeroko stosowane w medycynie jako metoda wyszukiwania chorób dziedzicznych i badania infekcji. (Zobacz na przykład „ Wyjaśnienie „rodowodu” stawonogów" oraz " Sk prawdziwa anegdota: Murzyn, Chińczyk i Craig Venter... ». - Ed.)

W rzeczywistości, chronologicznie, metody zostały wynalezione w zupełnie innej kolejności. Na przykład sekwencjonowanie Sangera opracowano w 1977 r., a PCR, jak wspomniano powyżej, dopiero w 1983 r.

Istnieje wiele różnych technik sekwencjonowania, ale wszystkie metody można podzielić na dwie kategorie: „klasyczne” i nowej generacji. Teraz w rzeczywistości stosowana jest tylko jedna „klasyczna” metoda - sekwencjonowanie Sangera lub metoda terminatora. W porównaniu z nowymi metodami ma ona istotną zaletę: długość odczytu, czyli liczba nukleotydów w sekwencji, jaką można uzyskać w jednym czasie, jest większa – do 1000 nukleotydów. Jednocześnie najbardziej „dobra” pod tym względem „nowa” metoda sekwencjonowania – 454-, czyli pirosekwencjonowanie – parametr ten nie przekracza 500 nukleotydów. Możliwości nowych metod ogranicza długość odczytu: niezwykle trudne okazuje się „złożenie” całego genomu z fragmentów o wielkości kilkudziesięciu nukleotydów. Wymaga to co najmniej superkomputerów, a niektóre miejsca w genomie są po prostu niemożliwe do rozpoznania, jeśli zawierają wysoce powtarzalne sekwencje. W takim przypadku porównanie uzyskanych fragmentów z już istniejącym całym genomem może pomóc, ale w ten sposób nie jest możliwe pierwsze odczytanie genomu organizmu ( od nowa). (Zobacz też: " Kodeks życia: czytać to nie rozumieć ». - Ed.)

Angielski biochemik i luminarz biologii molekularnej, dwukrotny laureat Nagrody Nobla w dziedzinie chemii: za określenie sekwencji aminokwasowej insuliny (1955) i opracowanie metody sekwencjonowania DNA (1980). - Ed.

Istnieje metoda nowej generacji, która pozwala odczytać kilka tysięcy monów, ale z dużymi błędami (Pacific Biosciences). 454/Roche może dziś przeczytać ponad 500 Mon; młode „sekwencjonowanie półprzewodników” może już zrobić to samo. - Ed.

Obie wymienione powyżej metody sekwencjonowania zostały już wystarczająco szczegółowo opisane na temat „biomolekuły”: zdecydowanie radzę się zapoznać. Na przykład opowiem o innej popularnej szybkiej i taniej metodzie (na jeden odczytany nukleotyd) - metodzie zaimplementowanej w sekwencerach Illumina (wideo 2). Jego główną wadą jest odczyt fragmentów o bardzo krótkiej długości, nie większej niż 100 nukleotydów i wynikająca z tego trudność w odczytaniu genomu od podstaw.

W tej metodzie można wyróżnić trzy etapy: przygotowanie biblioteki fragmentów (1), utworzenie klastrów (2) oraz samo sekwencjonowanie (3).

Wideo 2. W Internecie jest kilka dobrych filmów, które opisują proces sekwencjonowania Illumina, na przykład na oficjalnej stronie internetowej firmy (zakładka Technologia). Jednak wszystkie są w języku angielskim.

Sporo już powiedziano o metodach pracy z kwasami nukleinowymi i ich badaniu. Czas dowiedzieć się, jak można dowiedzieć się, jak działa komórka - w szczególności spróbuj określić funkcję genu i białka, które koduje.

in vitro-mutageneza

Aby zbadać funkcję białka, bardzo ważne jest, aby nauczyć się, jak je wprowadzać mutacje. Na przykład, jeśli masz organizm z niedziałającym enzymem, możesz zrozumieć różnice biochemiczne, co robi normalne białko. Istnieją różne sposoby na stworzenie całkowicie niedziałającego genu (zarówno arbitralne z całego genomu, jak i całkowicie specyficzne - wtedy nazywa się to Nokaut ten gen). Jedną z tych metod jest wstawienie fragmentu DNA do genomu: jeśli ta insercja padnie na gen, to (a dokładniej, najprawdopodobniej białko, które koduje) przestanie normalnie funkcjonować.

Istnieją jednak sposoby bardzo precyzyjnej zmiany sekwencji genu, a tym samym białka. O jednej z tych metod - mutagenezy specyficznej dla miejsca- Powiem ci. Jej istotą jest zmiana określonego (zwykle jednego) nukleotydu w sekwencji. Aby go użyć, musisz najpierw sklonować ten gen w plazmidzie. Następnie konieczne jest przeprowadzenie niejako PCR z jednym starterem. Co więcej, ten elementarz powinien zawierać tylko sekwencję, którą chcemy zmienić - już w takiej formie, jakiej potrzebujemy. Na przykład na ryc. 14 zamiast litery A, która powinna znajdować się naprzeciw T w łańcuchu macierzystym, starter zawiera C. Po syntezie drugiej nici DNA plazmidu zawierającego starter, zostanie w nim wprowadzona mutacja - A będzie zastąpione przez C. Takie plazmidy są wprowadzane do komórek, w których podczas podziału dwa łańcuchy trafią do różnych komórek potomnych. Tak więc połowa komórek potomnych będzie miała oryginalną wersję plazmidu, a połowa zmutowaną. Wtedy odpowiednio połowa komórek wytworzy normalne białko kodowane przez ten gen, a połowa zmutowane. W przypadku pokazanym na rys. 14, zamiast jednego aminokwasu (asparaginy) pojawi się inny (alanina). Analogicznie, losowe mutacje można wprowadzić za pomocą specjalnej polimerazy DNA, która wprowadza zwiększoną liczbę błędów.

Ryc. 14. Schemat mutagenezy specyficznej dla miejsca.C.elegans, - czyli o wyłączeniu genu we wszystkich (prawie) komórkach tego robaka.

Tak uderzający efekt uzyskuje się poprzez wprowadzenie do komórki dwuniciowych cząsteczek RNA (dsRNA), w których jeden z łańcuchów jest komplementarny do sekcji mRNA „wyłączonego” genu. Otwiera to niesamowite możliwości badania funkcji genów. Wcześniej, aby wyłączyć geny, trzeba było stworzyć zwierzęta „nokautujące” (co naukowcy wciąż muszą robić np. z myszami – patrz „ Nagroda Nobla w dziedzinie fizjologii lub medycyny przyznana za technologię nokautowania myszy ». - Ed.), w którym badany gen zasadniczo nieobecny w genomie. Jednak tworzenie nokautów jest dość trudne, a ponowne włączenie genu w takich organizmach nie jest już możliwe. Za pomocą interferencji RNA bardzo łatwo jest wyłączyć gen, tak samo jak go włączyć, po zaprzestaniu wprowadzania odpowiedniego dsRNA do organizmu.

Istnieją trzy główne sposoby wprowadzania dsRNA do organizmu. Najbardziej oczywistym jest wstrzyknięcie ich roztworu zwierzęciu. Używają również „namaczania” nicieni w roztworze RNA. Okazało się jednak, że wszystko można zrobić o wiele prościej: nakarmić te cząsteczki nicieniami! Co więcej, szczególnie wygodne jest to, że świetnie działa również wtedy, gdy nicienie są karmione bakteriami ( E coli), które syntetyzują te dsRNA (ryc. 15).

Rycina 15. Ogólnoustrojowa interferencja RNA. Robak C.elegans wyraża zielone fluorescencyjne (świetliste) białko w komórkach gardła (ph) i mięśniach ściany ciała (bm). Lewy- początkowy wygląd. Po prawej- podczas interferencji RNA za pomocą „karmienia” przez bakterie następuje inaktywacja genu.

Zasadniczo fakt, że cząsteczki RNA z jelit są rozprowadzane do prawie wszystkich tkanek, jest dość zaskakujący. Wiadomo, że za wnikanie cząsteczek RNA do komórek jelitowych odpowiada kanał białkowy. sid-1, . Jednak nie wiadomo na pewno, w jaki sposób RNA jest rozprowadzane w ciele robaka, najprawdopodobniej z udziałem białka. rsd-8 Co ciekawe, wszystkie znane białka zaangażowane w ogólnoustrojową interferencję RNA w C.elegans, występują również u ludzi, ale tak skutecznego systemu sztucznego tłumienia aktywności genów na poziomie ogólnoustrojowym u ludzi nie można zaobserwować. Gdyby możliwe było zastosowanie ogólnoustrojowego RNAi u ludzi, mogłoby to być sposobem na walkę z ogromną gamą chorób, od zwykłego przeziębienia po raka.

Nawiasem mówiąc, zastosowanie interferencji RNA w hodowli komórek ludzkich umożliwiło ujawnienie tak wielu ludzkich genów brać w czymś udział rozwój wirusa grypy: Dwulicowość molekularna: ludzkie geny działają na wirusa grypy ». - wyd.

Badanie ekspresji genów: mikromacierze DNA

Podczas badania funkcji genu bardzo ważne jest, aby dowiedzieć się, kiedy iw jakich tkankach organizmu on działa (jest wyrażany), a także razem z jakimi innymi genami. Jeśli chcesz to wiedzieć o niewielkiej liczbie genów i tkanek, możesz to zrobić bardzo prosto: wyizolować RNA z tkanki, odwrócić transkrypcję (czyli zsyntetyzować cDNA - komplementarne DNA), a następnie przeprowadzić ilościową reakcję PCR. W zależności od tego, czy PCR przeszedł pomyślnie, dowiemy się, czy w tkance znajduje się mRNA badanego genu.

Jeśli jednak konieczne jest zrobienie tego samego dla wielu tkanek i wielu genów, technika ta staje się bardzo długa i kosztowna. W takim razie użyj mikromacierze DNA. Są to małe płytki, na które nakłada się i przyczepia molekuły DNA, komplementarne do RNA badanych genów i z góry wiadomo, gdzie na nich (płytki), która cząsteczka się znajduje. Jednym ze sposobów stworzenia chipa jest synteza cząsteczek DNA bezpośrednio na nim za pomocą robota.

Aby badać ekspresję genów za pomocą chipów, konieczna jest również synteza ich cDNA i znakowanie go barwnikiem fluorescencyjnym (bez rozdzielania cDNA różnych genów). Ta mieszanina jest nakładana na mikrochip, zapewniając hybrydyzację cDNA z cząsteczkami DNA na chipie. Następnie przyglądają się, gdzie obserwuje się fluorescencję i porównują ją z lokalizacją cząsteczek DNA na chipie. Jeśli miejsce fluorescencji pokrywa się z pozycją cząsteczki DNA, to gen ten ulega ekspresji w tej tkance. Ponadto, znakując cDNA z różnych tkanek różnymi barwnikami, można jednocześnie badać ekspresję kilku (zwykle nie więcej niż 2) tkanek na jednym chipie: kolor fluorescencji można wykorzystać do określenia, w której tkance jest wyrażany (jeśli jest wyrażany w kilku tkankach jednocześnie, okaże się, że jest mieszany). kolor) (ryc. 16).

Jednak w ostatnich latach zamiast czipów zaczęto masowo sekwencjonować całe cDNA z tkanki (tworzenie tzw. transkryptomy), co zostało znacznie uproszczone dzięki rozwojowi metod sekwencjonowania. Okazuje się to tańsze i wydajniejsze, ponieważ znajomość kompletnych sekwencji wszystkich mRNA dostarcza więcej informacji niż sam fakt ich obecności lub braku.

Dokonaliśmy przeglądu podstawowych metod biologii molekularnej. Mam nadzieję, że stało się dla Ciebie trochę jaśniejsze, w jaki sposób prowadzi się badania z zakresu biologii molekularnej, do czego służą Nagrody Nobla i jak mogą one pomóc w niektórych problemach aplikacyjnych. Ale przede wszystkim mam nadzieję, że ty również dostrzegłeś piękno stojących za nimi pomysłów i być może chciałbyś dowiedzieć się więcej o niektórych z tych technik.

Literatura

1. Laureaci Nagrody Nobla: J. Watson, F. Crick, M. Wilkins, Wikipedia: sekwencjonowanie 454 (wysokoprzepustowe pirosekwencjonowanie DNA). Sympozja Cold Spring Harbor na temat biologii ilościowej. 71 , 95-100.

dla kogo? Gimnazjaliści, studenci.
Co daje? Znajomość podstaw biologii molekularnej.
Nauczyciele. Kierownik Laboratorium Genetyki Molekularnej Mikroorganizmów w Instytucie Biologii Genów Rosyjskiej Akademii Nauk, profesor Rutgers University (USA), profesor w Instytucie Nauki i Technologii Skolkovo (SkolTech).
Gdy? Należy to wyjaśnić.
Cena £. 9 000 rub.
Warunki uczestnictwa. Konieczne jest pozostawienie zgłoszenia uczestnictwa na stronie.

Kręgi biologiczne. Uniwersytet Państwowy w Moskwie MV Łomonosow.

dla kogo? klasy 9-11.
Co daje? Znajomość biologii, umiejętność wykonywania prac projektowych, umiejętność pracy w laboratorium.
Nauczyciele. Pracownicy wydziału biologicznego Moskiewskiego Uniwersytetu Państwowego.
Gdy?
Cena £. Należy to wyjaśnić.
Warunki uczestnictwa. Należy to wyjaśnić.

Wydział biologiczny moskiewskiego gimnazjum nr 1543 na południowym zachodzie.

dla kogo? 7-10 stopni.
Co daje? Zaawansowana wiedza z biologii.
Nauczyciele. Pracownicy Moskiewskiego Uniwersytetu Państwowego, absolwenci gimnazjum.
Gdy? Istnieje możliwość śledzenia daty rozpoczęcia rekrutacji.
Obowiązkowe wymagania. Konieczne jest zdanie egzaminów wstępnych.
Cena £. Bezpłatnie (istnieje dobrowolna składka).
Warunki uczestnictwa. Wstęp do gimnazjum w celu pełnej edukacji.

Szkoła „Chem*Bio*Plus”. Rosyjski Narodowy Uniwersytet Medyczny im. N.I. Pirogow.

dla kogo? 10-11 stopni.
Co daje? Znajomość biologii, chemii.
Gdy? Zestaw - corocznie, we wrześniu.
Obowiązkowe wymagania. Ustaw na podstawie wyników testów.
Cena £. 10 000 - 75 000 rubli (jest lekcja próbna).

Akademia. „PostNauka”.

dla kogo? Uczniowie, studenci.
Co daje?

• wiedza z zakresu fizyki cząstek elementarnych, chemii, medycyny, matematyki, neurofizjologii, genetyki, socjologii, informatyki;
• wiedza o tym, jak osiągnięcia naukowe są stosowane w prawdziwym życiu.

Nauczyciele. Wysoko wykwalifikowani specjaliści, naukowcy.
Gdy? Istnieje możliwość śledzenia terminów rekrutacji W kontakcie z oraz Facebook.
Cena £. 9 000 rub.
Warunki uczestnictwa. Musisz obrać właściwy kurs. Zapisz się na kurs i zapłać za kurs.

Pietrozawodsk

Centrum STEM Państwowego Uniwersytetu w Pietrozawodsku.

dla kogo? 1-11 klas.
Co daje? Umiejętności projektowe, działalność badawcza z zakresu programowania, biologii, chemii, fizyki.
Gdy? Istnieje możliwość śledzenia daty rozpoczęcia rekrutacji.
Cena £. Należy to wyjaśnić.
Warunki uczestnictwa. Uczniowie szkół w Pietrozawodsku.

Otwarte Liceum Uniwersyteckie Pietrozawodskiego Uniwersytetu Państwowego.

dla kogo? klasa 10.
Co daje?

• kierunek techniczny (fizyka, matematyka, informatyka, język rosyjski);
• biomedyczny (chemia, biologia, język rosyjski).

Gdy? Istnieje możliwość śledzenia daty rozpoczęcia rekrutacji.
Cena £. Należy to wyjaśnić.
Warunki uczestnictwa. Obywatelstwo Federacji Rosyjskiej, wniosek, czesne.

Kursy mistrzowskie

„Budowa i funkcje komórki” – lekcja w muzeum.

dla kogo? 14-16 lat.
Co daje?

• praktyczne umiejętności z biologii;
• umiejętności mikroskopowe;
• umiejętność eksperymentowania.

Gdy? Należy to wyjaśnić.
Cena £. Należy to wyjaśnić.
Trwanie. 90 minut.
Specjalne warunki zwiedzania. Ostatni wtorek miesiąca jest dniem sanitarnym.
Jak się zarejestrować? Zostaw prośbę na stronie.

„Świat pod mikroskopem”.

dla kogo? 6–16 lat.
Co daje? Obserwacja mikroorganizmów, struktura komórkowa pod mikroskopem.
Gdy? Należy to wyjaśnić.
Cena £. 200 r.
Trwanie. 1 godzina.
Specjalne warunki zwiedzania. Zajęcia grupowe (dla gości od 6 roku życia) odbywają się w weekendy i ferie według grafiku.
Jak się zarejestrować? Zostaw prośbę na stronie.

Lekcja chemii „Najbardziej niesamowita substancja na Ziemi”.

dla kogo? 14-16 lat.
Co daje?

• wiedza o właściwościach wody;
• umiejętność prowadzenia eksperymentów laboratoryjnych.

Gdy? Należy to wyjaśnić.
Cena £. 16 000 rubli dla dwuosobowej grupy po 15 osób każda.
Trwanie. 90 minut.

obozy

region Moskwy

Obóz chemiczny „Słoń i żyrafa”.

dla kogo? klasy 9-11.
Gdy? Rocznie.
Co daje?

• znajomość chemii;
• umiejętności odczynników.

Uwaga: programy szkoleń zmieniają się co zmianę, dlatego konieczne jest doprecyzowanie ich treści z organizatorami.
Nauczyciele. Wysoko wykwalifikowani lekarze różnych specjalności, zawodowi biolodzy, naukowcy.
Cena £. 32 000 rubli
Warunki uczestnictwa. Musisz złożyć wniosek na stronie.

Centrum Edukacyjne Syriusza. Kierunek „Nauka”. Zmiany „Chemia”, „Biologia”.

dla kogo? 10-17 lat.
Co daje? Dogłębna znajomość podstawowych przedmiotów, poszerzanie horyzontów i rozwój osobisty.
Nauczyciele. Naukowcy, nauczyciele czołowych uczelni, szkół fizyczno-matematycznych i chemiczno-biologicznych, trenerzy drużyn narodowych i regionalnych z matematyki, fizyki, chemii i biologii.
Gdy? Rocznie. Istnieje możliwość śledzenia terminów rekrutacji.
Obowiązkowe wymagania. Głęboka znajomość przedmiotów specjalistycznych, poziom ogólnorosyjskich, międzynarodowych olimpiad.
Cena £. Za darmo.
Warunki uczestnictwa. Aplikuj na stronie. Istnieje możliwość wyboru konkurencyjnego. Szczegóły należy sprawdzić u organizatorów lub śledzić na stronie internetowej.

uniwersytety

Uniwersytet Państwowy w Moskwie MV Łomonosow.

Katedra Biologii.
Rok powstania: 1930.
Co daje?
Kwalifikacja:

Rosyjski Narodowy Uniwersytet Medyczny im. N.I. Pirogow.

Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej.
Rok powstania: 1963.
Co daje? Przygotowuje wykwalifikowanych specjalistów.
Kwalifikacja: specjalista, staż - 6 lat.

Nowosybirsk

Nowosybirski Uniwersytet Państwowy.

Wydział Nauk Przyrodniczych. Dział biologiczny. Katedra Biologii Molekularnej.
Rok powstania: 1959.
Co daje? Przygotowuje wykwalifikowanych specjalistów.
Kwalifikacja: licencjat, okres studiów - 4 lata, magister - 2 lata.

Kursy online

Po rosyjsku

„Prawdziwa matematyka”. Elektroniczna szkoła „Znanika”.

dla kogo? klasy 5-9.
Co daje? Głęboka znajomość matematyki.
Gdy? kiedykolwiek.
Nauczyciele. Kandydaci nauk fizycznych i matematycznych, pedagogicznych, docentowie, profesorowie i nauczyciele wiodących uczelni w kraju.
Warunki uczestnictwa. Wymagamy rejestracji.

Wirtualne laboratorium chemiczne. Mari State Technical University.

dla kogo? 8-11 klas.
Co daje? Umiejętność pracy w laboratorium chemicznym, umiejętność wykonywania eksperymentów w czasie rzeczywistym.
Cena £. 3 500 - 9 000 rubli
Warunki uczestnictwa. Sprawdzić.

Marka Zentrum. Międzynarodowe centrum edukacyjne online.

dla kogo? Od 11 lat.
Co daje? Programy edukacyjne z biologii, chemii, matematyki, języków obcych.
Gdy? Zajęcia indywidualne są uzgadniane z lektorem. Zajęcia grupowe odbywają się zgodnie z harmonogramem.
Nauczyciele. Językoznawcy, praktykujący nauczyciele przedmiotów specjalistycznych.
Cena £. Lekcja próbna jest bezpłatna. Lekcje indywidualne: jedna lekcja - 450-1200 rubli, w zależności od liczby lekcji (minimum pięć) i czasu trwania lekcji. Lekcje grupowe: jedna lekcja - 280-640 rubli.
Koszt zajęć z języków obcych. Lekcja próbna z native speakerem- płatne: 10 euro. Koszt jednej lekcji: 15-35 euro, w zależności od czasu trwania lekcji.
Trwanie. Zależy od formy pracy. Lekcja indywidualna - 45–90 minut, lekcja grupowa - 90 minut, webinar - 120 minut. Pierwsza lekcja próbna trwa 30-40 minut.
Warunki uczestnictwa. Wypełnij formularz zgłoszeniowy na lekcję próbną.
Specjalne warunki. Niezbędne materiały i podręczniki nauczyciel przesyła w formie elektronicznej (istnieje możliwość zakupu materiałów do nauki w formie drukowanej).

Po angielsku

Wykład. Niespodzianki i odkrycia w katalizie.

dla kogo? Uczniowie, studenci.
Co daje? Znajomość najnowszych osiągnięć katalizy.
Nauczyciele. Erick M. Carreira, profesor chemii organicznej na Uniwersytecie w Zurychu.
Gdy? kiedykolwiek.
Cena £. Za darmo.

Virtulab z chemii w języku angielskim. Istnieje możliwość ustawienia języka rosyjskiego.

dla kogo? Uczniowie.
Co daje? Umiejętność pracy w laboratorium z setkami odczynników w czasie rzeczywistym.
Gdy? kiedykolwiek.
Cena £. Za darmo.

Detektyw chemiczny virtulab. Śledztwo w sprawie przestępstwa z pomocą wiedzy chemicznej.

dla kogo? Uczniowie, studenci.
Co daje? Umiejętność zastosowania wiedzy chemicznej w zabawny sposób.
Gdy? kiedykolwiek.
Czas trwania zadania. 40–50 minut.
Cena £. Za darmo.
Warunki uczestnictwa. Pobierz program na swój komputer.